Dosage basé sur la bioluminescence cellulaire : une méthode à haut débit pour le criblage combinatoire de médicaments

Abstract

Source : Hu, Z. et al. Un flux de travail de dépistage rapide pour identifier une thérapie combinée potentielle pour le GBM à l’aide de cellules souches de gliome dérivées de patients.J. Vis. Exp.(2021)

Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode mettant en évidence l’utilité du dosage de la bioluminescence pour le criblage sensible et rapide des médicaments. Ces médicaments peuvent être testés seuls ou en association pour évaluer la synergie de leur mode d’action.

Protocol

1. Mesure de la viabilité cellulaire basée sur la bioluminescence

1. Revêtement des plaques avec le mélange de matrice extracellulaire (ECM) (par exemple, Matrigel) : Ajouter 40 μL de mélange ECM à 0,15 mg/mL dans chaque puits et incuber la plaque pendant 1 h à 37 °C. Retirer l’excès de mélange ECM et rincer doucement une fois avec du PBS.
2. Ajoutez dans chaque puits un milieu de culture de 100 μL contenant 15 000, 10 000, 8 000, 6 000, 4 000, 2 000, 1 000 et 500 cellules XG387-Luc ainsi qu’un milieu vierge de 100 μL comme témoin pour 6 répétitions dans une plaque inférieure optique à 96 puits et cultivez les cellules pendant la nuit à 37 °C.
3. Retirer le surnageant, ajouter 50 μL de milieu de culture contenant 150 ng/μL de D-luciférine dans chaque puits et incuber les cellules pendant 5 min à 37 °C.
4. Prenez des images de la bioluminescence cellulaire dans la plaque à l’aide du système d’imagerie spectrale IVIS. Utilisez le logiciel intégré pour créer plusieurs zones circulaires de la région d’intérêt (ROI) et quantifier la bioluminescence cellulaire.

2. Traitement au témozolomide et dépistage combiné

1. Pré-enduire quatre plaques de 96 puits comme décrit ci-dessus à l’étape 1, avant le traitement.
2. Implantez des cellules XG387-Luc à une densité de 1 000 cellules dans un milieu de culture de 100 μL dans chaque puits d’une plaque inférieure optique à 96 puits et cultivez les cellules pendant la nuit.
3. Préparez à l’avance le témozolomide et les agents ciblés à partir de la solution mère. Préparer une série de concentrations composée de 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM et 50 μM de témozolomide dans un milieu de culture pour le traitement en monothérapie. Diluer le témozolomide et les agents ciblés en solution mère dans le milieu de culture, respectivement, pour obtenir des concentrations finales de 200 μM et 2 μM pour le criblage de médicaments combinés (liste des matériaux).
4. Retirer le milieu de culture lorsque la plupart des CSG adhèrent au fond des plaques ; ajouter le milieu préparé ci-dessus contenant du témozolomide dans chaque puits pour trois répétitions techniques par traitement.
5. Pour traiter le témozolomide et pour cribler les associations médicamenteuses, prélever le milieu blanc et ajouter le milieu préparé ci-dessus contenant soit 200 μM de témozolomide, soit 2 μM d’agent ciblé, ou une combinaison des deux dans chaque puits pour trois répétitions techniques par traitement.
6. Incuber toutes les plaques à 37 °C, 5 % CO₂ pendant 3 jours.
7. Retirez le milieu contenant le médicament, ajoutez 50 μL de milieu vierge contenant 150 ng/μL de D-luciférine dans chaque puits et incubez les cellules pendant 5 min à 37 °C.
8. Prenez des images de la bioluminescence cellulaire dans la plaque à l’aide du système d’imagerie spectrale IVIS. Utilisez le logiciel intégré pour créer plusieurs zones d’intérêt circulaires et quantifier la bioluminescence cellulaire.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	Gibco	Référence 17504-044	50 fois
FEM	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100 fois
Neurobasale	Gibco	21103049	1 fois
Pénicilline-streptomycine	HyClone	SV30010	P : 10 000 unités/ml S : 10 000 ug/ml
Pyruvate de sodium	Gibco	2088876	100 millions d’euros
ABT-737	MCE		Inhibiteur sélectif et mimétique de BH3 Bcl-2, Bcl-xL et Bclw
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Inhibiteur de Wee1
L’axitinib	MCE		Inhibiteur de tyrosine kinase multi-cible
AZD5991	MCE		Inhibiteur de Mcl-1
A 83-01	MCE		Inhibiteur puissant de la kinase ALK5 du récepteur du TGF-β de type I
CGP57380	Selleck		Puissant inhibiteur de MNK1
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Double inhibiteur de PI3K compétitif ATP et mTOR
Le dasatinib	MCE		Inhibiteur double de la tyrosine kinase de la famille Bcr-Abl et Src
L’erlotinib	MCE		Inhibiteur de la tyrosine kinase EGFR
Gefitinib	MCE		Inhibiteur de la tyrosine kinase EGFR
Linifanib	MCE		Inhibiteur multi-cibles de la famille des VEGFR et PDGFR
Le masitinib	MCE		Inhibiteur du c-Kit
Réf. ML141	Selleck		Inhibiteur non compétitif de la Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Inhibiteur multi-cibles de Kit, KDR et CSF-1R
Le palbociclib	MCE		Inhibiteur sélectif de CDK4 et CDK6
SB 202190	MCE		Inhibiteur sélectif de la kinase p38 MAP
Bromure de sépantronium (YM-155)	MCE		Inhibiteur de la survivine
TCS 359	Selleck		Puissant inhibiteur de FLT3
UMI-77	MCE		Inhibiteur sélectif de Mcl-1
4-hydroxytamoxifène (afimoxifène)	Selleck		Modulateur sélectif des récepteurs d’œstrogènes (RE)