Isolement basé sur la SEC de vésicules extracellulaires dérivées de la microglie : une technique pour isoler des vésicules extracellulaires à partir de milieux de culture conditionnés par la microglie

Résumé

Source : Lemaire, Q. et al. Caractérisation des vésicules extracellulaires dérivées de cellules immunitaires et étude de l’impact fonctionnel sur l’environnement cellulaire. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo décrit une méthode basée sur la chromatographie d’exclusion stérique (SEC) pour isoler les vésicules extracellulaires ou EV dérivées des cellules immunitaires du cerveau, la microglie. Les VE agissent comme une cargaison moléculaire pour délivrer des médiateurs, qui régulent une réponse immunitaire. Par conséquent, les VE isolés peuvent être utilisés comme modèle in vitro pour étudier la diaphonie microglie-neurone au cours d’une réponse immunitaire neuronale.

Protocole

1. Culture primaire de microglies/macrophages

1. Culture primaire de la microglie
   1. Culture commerciale de la microglie primaire de rat (2 x 10⁶ cellules) (voir le tableau des matières) dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum sans exosome, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 9,0 g/L de glucose à 37 °C et 5 % de CO₂.
   2. Recueillir le milieu conditionné après une culture de 48 h et procéder à l’isolement des VE.
2. Culture primaire de macrophages
   1. Culture de macrophages primaires de rat commercial (1 x 10⁶ cellules) dans le milieu fourni par le fabricant (voir le tableau des matériaux) à 37 °C et 5 % de CO₂, avec du sérum exempt d’exosomes.
   2. Recueillir le milieu conditionné après une culture de 24 h et procéder à l’isolement des VE.

2. Isolation des VE

1. Pré-isolement des VE du milieu conditionné
   1. Transférez le milieu de culture conditionné à partir de cultures de microglies ou de macrophages (étapes 1.1.2 ou 1.2.2) dans un tube conique.
   2. Centrifugeuse à 1 200 x g pendant 10 min à température ambiante (RT) pour granuler les cellules.
   3. Transférez le surnageant dans un nouveau tube conique. Centrifugeuse à 1 200 x g pendant 20 min à RT pour éliminer les corps apoptotiques.
   4. Transférez le surnageant dans un tube en polycarbonate de 10,4 mL et transférez le tube dans un rotor de 70,1 Ti. Ultracentrifugeuse à 100 000 x g pendant 90 min à 4 °C pour granuler les VE.
   5. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille contenant des VE dans 200 μL de solution saline tampon phosphate filtrée (PBS) de 0,20 μm.
2. Isolation des VE
   1. Préparation de la colonne de chromatographie d’exclusion stérique (SEC) faite maison
      1. Videz une colonne de chromatographie sur verre (longueur : 26 cm ; diamètre : 0,6 cm) (voir la Table des matériaux), lavez-la et stérilisez-la.
      2. Placez un filtre de 60 μm au bas de la colonne.
      3. Empilez la colonne avec une matrice de base de filtration sur gel d’agarose réticulé pour créer une phase stationnaire de 0,6 cm de diamètre et de 20 cm de hauteur.
      4. Rincer la phase avec 50 mL de PBS filtré à 0,20 μm. Conserver à 4 °C pour une utilisation ultérieure si nécessaire.
   2. Placez le plomb EV remis en suspension sur la phase stationnaire de la colonne SEC.
   3. Recueillir 20 fractions séquentielles de 250 μL tout en continuant à ajouter du PBS filtré de 0,20 μm sur le dessus de la phase stationnaire pour éviter le dessèchement de la colonne. Stockez les fractions à -20 °C si nécessaire.
      note: Un stockage plus long qu’une semaine peut être effectué à -80 °C pour maintenir l’intégrité de l’EV pour l’analyse moléculaire.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu de culture de macrophages et de microglies de rat	Applications cellulaires	R620K-100	Origine cellulaire : Normal et sain Rat moelle
Microglie primaire du rat	Lonza	RG535
Sepharose CL-2B	GE Soins de santé	17014001
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Référence A95765
Rotor d’ultracentrifugeuse 70.1 Ti	Beckman Coulter	342184
glucose	Sigma-Aldrich	Référence G8769
Tampon phosphate salin	Invitrogen	14190094	Sans calcium, sans magnésium
Tubes à centrifuger en polycarbonate	Beckman Coulter	355651
Pénicilline-streptomycine	Gibco	Référence 15140-122
Exo-FBS	Ozyme	EXO-FBS-50A-1	FBS appauvri en exosomes
DMEM Gibco 41966029
centrifugeuse	Eppendorf	5804000010
Incubateur à CO2	ThermoFisher
pluriStrainer M/ 60 μm	pluriSelect	43-50060
Colonne MonoP FPLC	GE Soins de santé		N’est plus disponible