Extraction basée sur SDS-PAGE de protéines associées aux vésicules extracellulaires : une procédure pour extraire des protéines des VE et les préparer à la digestion en gel

Résumé

Source : Lemaire, Q. et al. Caractérisation des vésicules extracellulaires dérivées de cellules immunitaires et étude de l’impact fonctionnel sur l’environnement cellulaire. J. Vis. Exp. (2020)

Dans cette vidéo, nous démontrons la méthode de digestion en gel SDS-PAGE pour l’extraction de protéines à partir de vésicules extracellulaires ou de VE. Une fois isolés, les fragments de protéines obtenus peuvent être utilisés pour l’analyse protéomique.

Protocole

1. Caractérisation des VE

1. Analyse par transfert Western
   1. Extraction des protéines
      1. Isolez les VE à l’aide d’une colonne de chromatographie d’exclusion stérique (SEC) et quantifiez-les à l’aide de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA).
      2. Mélanger 50 μL de tampon RIPA (150 mM de chlorure de sodium [NaCl], 50 mM de Tris, 5 mM d’éthylène glycol-bis(2-aminoéthylétre)-N,N,N′,N′-acide tétraacétique [EGTA], 2 mM d’acide éthylènediamine-tétraacétique [EDTA], 100 mM de fluorure de sodium [NaF], 10 mM de pyrophosphate de sodium, 1 % de nonidet P-40, 1 mM de fluorure de phénylméthanesulfonyle [PMSF], 1x inhibiteur de protéase) avec l’échantillon de VE (25 μL résultant de la concentration de VE sur le filtre) pendant 5 min sur glace pour extraire des protéines.
      3. Sonicate pendant 5 s (amplitude : 500 W ; fréquence : 20 kHz), 3 fois sur glace.
      4. Éliminer les débris vésiculaires par centrifugation à 20 000 x g pendant 10 min, à 4 °C.
      5. Prélevez le surnageant et mesurez la concentration en protéines à l’aide de la méthode de dosage des protéines de Bradford.
   2. Électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE) et western blot
      1. Mélanger les extraits de protéines (30 μg) avec le tampon d’échantillon 5c Laemmli (v/v).
      2. Chargez le mélange de protéines sur un gel de polyacrylamide à 12 %.
      3. Migrez les protéines dans le gel avec le tampon TGS (25 mM Tris pH 8,5, 192 mM de glycine et 0,1 % SDS), à 70 V pendant 15 min et 120 V pendant 45 min.
      4. Transvaser les protéines sur une membrane de nitrocellulose avec un système semi-sec à 230 V pendant 30 min.
      5. Saturer la membrane pendant 1 h à la RT avec un tampon bloquant (0,05 % Tween 20 p/v, 5 % de lait en poudre p/v dans 0,1 M PBS, pH 7,4).
      6. Incuber la membrane pendant la nuit à 4 °C avec l’anticorps monoclonal de souris anti-protéine de choc thermique humain 90 (HSP90) dilué dans un tampon bloquant (1:100).
      7. Laver la membrane trois fois avec du PBS-Tween (PBS, 0,05 % Tween 20 p/v) pendant 15 min.
      8. Incuber la membrane pendant 1 h à l’ATR avec un anticorps secondaire IgG anti-souris conjugué au raifort de chèvre et à la peroxydase dilué dans un tampon bloquant (1:10 000).
         REMARQUE : Un contrôle négatif est effectué à l’aide d’anticorps secondaires seuls.
      9. Répétez l’étape de lavage (étape 1.1.2.7).
      10. Révélez la membrane avec le kit de substrat de transfert western à chimiluminescence améliorée (ECL) (voir le tableau des matériaux).

2. Analyse protéomique

1. Extraction de protéines et digestion en gel
   1. Isolez les VE à l’aide d’une colonne de chromatographie d’exclusion stérique (SEC) et quantifiez-les à l’aide de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA). Répétez l’étape 1.1.1 pour l’extraction de la protéine EV.
   2. Effectuez la migration des protéines dans le gel d’empilement d’un gel de polyacrylamide à 12 %.
   3. Fixez les protéines dans le gel avec du bleu de Coomassie pendant 20 min à RT.
   4. Excisez chaque morceau de gel coloré et coupez-le en petits morceaux de 1 mm³.
   5. Laver successivement les morceaux de gel avec 300 μL de chaque solution : eau ultra-pure pendant 15 min, 100 % acétonitrile (ACN) pendant 15 min, 100 mM de bicarbonate d’ammonium (NH₄HCO₃) pendant 15 min, ACN : 100 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) pendant 15 min, et 100 % ACN pendant 5 min avec agitation continue.
   6. Séchez complètement les morceaux de gel avec un concentrateur sous vide.
   7. Effectuer la réduction des protéines avec 100 μL de 100 mM de NH₄HCO₃ contenant 10 mM de dithiothréitol pendant 1 h à 56°C.
   8. Effectuer l’alkylation des protéines avec 100 μL de 100 mM de NH₄HCO₃ contenant 50 mM d’iodoacétamide pendant 45 min dans l’obscurité à RT.
   9. Laver successivement les morceaux de gel avec 300 μL de chaque solution : 100 mM de NH₄HCO₃ pendant 15 min, ACN : 20 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) pendant 15 min, et 100 % ACN pendant 5 min en remuant continuellement.
   10. Séchez complètement les morceaux de gel à l’aide d’un concentrateur sous vide.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
acétonitrile	Produits chimiques Fisher	A955-1
Bicarbonate d’ammonium	Sigma-Aldrich	Référence 9830
Anticorps HSP90 α/β (RRID : AB_675659)	Santa-cruz	SC-13119
Concentré de réactif de colorant pour dosage de protéines Bio-Rad (Bradford)	Bio-Rad	5000006
Le dithiothréitol	Sigma-Aldrich	Réf. 43819
Acide éthylèneglycol-bis(2-aminoéthylétre)-N,N,N′,N′-tétraacétique	Sigma-Aldrich	Référence 03777-10G
Acide éthylènediaminetétraacétique	Sigma-Aldrich	ED-100G
Fisherbrand Q500 Sonicateur avec sonde	Fisherbrand	12893543
L’idoacétamide	Sigma-Aldrich	I1149
Teinture protéinée InstantBlue Coomassie	Expedeon	ISB1L (en
Laemmli 2x	Bio-Rad	1610737
Nonidet P-40	Fluka	Référence 56741
Peroxydase AffiniPure Goat AntiMouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	Référence 115-035-003
Conjugué phalloïdine-tétraméthylrhodamine	Santa-cruz	SC-362065
Inhibiteur de la protéase	Sigma-Aldrich	Réf. S8830-20TAB
chlorure de sodium	Scharlau	SO0227
Dodécylsulfate de sodium	Sigma-Aldrich	L3771
Fluorure de sodium	Sigma-Aldrich	S7920-100G
Pyrophosphate de sodium	Sigma-Aldrich	S6422-100G
Concentrateur sous vide SpeedVac	ThermoFisher
Cellule de transfert semi-sèche Trans-Blot SD	Bio-Rad	1703940