Implantation d’une fenêtre d’imagerie crânienne dans un modèle murin : une procédure chirurgicale pour implanter une lamelle à base de verre pour un accès optique stable aux régions du cerveau murin

Résumé

Source : Alieva, M. et al. Imagerie intravitale longitudinale du comportement des cellules tumorales cérébrales en réponse à une biopsie chirurgicale invasive.J. Vis. Exp.(2019)

Cette vidéo présente une procédure chirurgicale visant à implanter une fenêtre crânienne dans un modèle de souris pour un accès optique stable à différentes régions du cerveau.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Implantation de cellules tumorales et préparation de la fenêtre d’imagerie crânienne

1. Préparation chirurgicale
   1. Utilisez des souris adultes (>6 semaines) de n’importe quelle souche ou sexe. Sédater une souris en injectant de la fluanisone [neuroleptique] + du fentanyl [opioïde]) (0,4 mL/kg) + un sédatif benzodiazépine (2 mg/kg) à une dose de 1:1:2 dans de l’eau stérile. Évaluez l'état de sédation de l'animal par pincement des orteils.
      note: Dans ce protocole, des souris C57BL/6 femelles et mâles ont été utilisées en raison du même patrimoine génétique de la lignée cellulaire tumorale utilisée dans ces expériences (GL261). La souris restera complètement sous sédation pendant 1,5 h. Vous pouvez également utiliser un anesthésique par inhalation tel que l’isoflurane (mélange 1,5 % à 2 % d’isoflurane/_O2).
   2. Montez la souris sur un cadre stéréotaxique et fixez la tête à l’aide d’un pince nasal et de deux barres d’oreille.
   3. Utilisez une lampe chauffante pour préserver la température corporelle. La lampe chauffante doit être utilisée avec prudence, ou des coussins chauffants à recirculation d’eau peuvent être utilisés.
   4. Appliquez une pommade pour les yeux pour protéger les cornées de la souris du dessèchement.
   5. Utilisez des ciseaux tranchants pour raser la fourrure du crâne (zone dorsale des yeux de la souris à la base de son crâne) et désinfectez la peau exposée avec de l'éthanol à 70 %.
   6. Coupez la peau de manière circulaire avec des ciseaux tranchants et grattez le périoste en dessous avec un coton-tige. Appliquez une goutte de lidocaïne 1 % + épinéphrine 1:100 000 pendant 5 min et retirez l’excédent à l’aide d’un coton-tige.
   7. Collez les bords de la peau sur le crâne avec de la colle cyanoacrylate.
   8. Placez le cadre stéréotaxique sous un microscope stéréoscopique de dissection avec un grossissement de 4x.
   9. Visualisez le crâne à travers le microscope de dissection et percez une rainure circulaire de 5 mm de diamètre sur l’os pariétal droit. Effectuez cette étape avec soin et seulement superficiellement, en évitant toute pression sur le crâne.
   10. Appliquez une goutte de tampon cortex (125 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 10 mM de glucose, 10 mM de tampon HEPES, 2 mM de MgSO₄ et 2 mM de CaCl₂ [pH 7,4]) et soulevez le lambeau osseux à l’aide d’une pince fine.
   11. Pour les étapes suivantes, gardez la surface du cerveau recouverte d’un tampon cortex, sauf indication contraire.
   12. Sous le microscope de dissection, visualisez la surface du cerveau et retirez la dure-mère à l’aide d’une pince à épiler incurvée, effilée et à pointe très fine. Si un saignement se produit à ce stade, utilisez une éponge de gélatine résorbable pour l’arrêter.

2. Préparation de la fenêtre d’imagerie crânienne

1. Retirez le tampon cortex et placez une goutte d’huile de silicone sur le site de la craniotomie pour éviter les bulles d’air sous la fenêtre.
2. Scellez le cerveau exposé à l’aide d’une lamelle de 6 mm. Appliquez de la colle cyanoacrylate entre la lamelle et le crâne. Appuyez doucement la lamelle contre le crâne à l’aide d’une pince à épiler fine pour assurer une distance minimale entre le cerveau et la lamelle.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Aiguilles hypodermiques de 25 G x 16 mm	BD Microlance
Éponge en gélatine résorbable	Pfizer	Référence 300600
Lamelles rondes 6 mm	VWR international		Mousse de gel
Colle cyanoacrylate	Pattex	Référence 631-0168	Gel Pattex Ultra
Ciment dentaire	Vertex Dentaire		Vertex autopolymérisable
forer	Dremel		Dremel 3000 (la fraise dentaire peut être plus pratique) + 105 Coupe-gravure
Pince à épiler fine incurvée	Dumont
Huile de silicone	Sigma Aldrich	AGT508
Cadre stéréotaxique	Stoelting	181838
Stéréomicroscope chirurgical	Olympe		Stéréotaxique de laboratoire, rat et souris
Pommade ophtalmique	Kela Veterinaria		Duodrops veter kela 10 m
Xylocaïne (lidocaïne 1 % + épinéphrine 1:100 000) Anesthésique local	Astrazeneca		Xylocaïne (lidocaïne 1 % + épinéphrine 1:100 000)
Hypnorm	VetaPharma Ltd		Hypnorm (citrate de fentanyl 0,315 mg/mL + Fluanison 10 mg/mL)
Le midazolam	Actavis		Midazolam Actavis 5 mg/mL