$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Imagerie intravitale
REMARQUE : L’intervalle de temps entre l’injection de cellules tumorales et la première séance d’imagerie intravitale dépend du type de lignée cellulaire tumorale utilisée. Pour les expériences présentées dans ce protocole, 1x 10cellules 5 GL261 ont été injectées et imagées 10 jours plus tard.
- Préparation de l’imagerie
- Sédatez la souris à l’aide d’une anesthésie par inhalation d’isoflurane à travers un masque facial (mélange d’isoflurane et d’O2 de 1,5 % à 2 %).
- Injectez à la souris par voie sous-cutanée 100 μL de tampon salin pour prévenir la déshydratation.
note: Pour l’imagerie à long terme, la souris peut être hydratée à l’aide d’une pompe à perfusion sous-cutanée.
- Placez la souris face vers le haut dans une boîte d’imagerie. Utilisez une plaque métallique avec un trou de 1 mm de diamètre et de petits aimants intégrés autour de l’ouverture pour assurer la fixation du CIW sur le boîtier d’imagerie. Introduire l’isoflurane à travers un masque facial et aérer par une sortie de l’autre côté de la boîte (mélange isoflurane 0,8 % à 1,5 % isoflurane/O2). Si vous le souhaitez, utilisez du ruban adhésif pour fixer le corps de la souris.
note: Du dextran marqué par fluorescence pour la visualisation des vaisseaux sanguins ou d’autres colorants peuvent être injectés par voie intraveineuse à ce stade.
- En option, utilisez un oxymètre de pouls et une sonde de chauffage pour surveiller les signes vitaux du mous.
note: Dans cette expérience, il n’a pas été nécessaire d’utiliser un oxymètre de pouls et une sonde chauffante puisque la souris était stable tout au long de la période d’imagerie (2 à 3 h). Cependant, pour des temps d’imagerie plus longs, une surveillance plus approfondie peut être nécessaire.
- Réglez l’objectif d’eau 25x (par exemple, HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 mm) sur la position z la plus basse et ajoutez une grosse goutte d’eau.
note: L’utilisation d’un microdistributeur à immersion dans l’eau est fortement recommandée pour les expériences à long terme, car il permet aux scientifiques d’ajouter de l’eau pendant l’expérience. Alternativement, un objectif sec peut être utilisé.
- Transférez le boîtier d’imagerie sur le microscope équipé d’une chambre climatique sombre maintenue à 37 °C. Amenez l’objectif sur la lamelle CIW jusqu’à ce que la goutte d’eau le touche.
- En utilisant le mode épifluorescence, observez la tumeur à travers l’oculaire et faites la mise au point sur les cellules.
2. Acquisition d’images en accéléré
- Sélectionnez plusieurs positions d’intérêt pour l’imagerie et enregistrez leurs coordonnées dans le logiciel. Assurez-vous que les positions sélectionnées sont des positions représentatives de différents sites de la tumeur (chaque tumeur peut être différente, mais pour assurer la cohérence, sélectionnez le même nombre de positions qui sont au centre du noyau de la tumeur et sur les bords de toutes les souris).
note: Un scan de tuiles d’une partie de la tumeur ou de l’ensemble de la tumeur visible peut être effectué ; Cependant, si la tumeur est grande, cette méthode augmentera le time-lapse entre les images. De plus, si les cellules tumorales se déplacent rapidement, il peut être difficile de suivre les mêmes cellules au fil du temps.
- Passez en mode multiphoton et réglez le laser sur la bonne longueur d’onde. Notez que pour éviter les photodommages, des longueurs d’onde plus élevées sont souhaitées.
note: Pour l’imagerie Dendra2, une longueur d’onde de 960 nm a été utilisée. Avec l’objectif utilisé dans ces expériences, un zoom de 1,3 était suffisant pour obtenir une bonne résolution des noyaux tumoraux et balayer une zone représentative de la tumeur.
- Passez en mode live et définissez une pile z pour chaque position afin d’acquérir le volume maximal de cellules tumorales sans compromettre la résolution des cellules tumorales. Définissez la taille du pas entre les images à 3 μm.
- Utilisez le mode bidirectionnel pour augmenter la vitesse de numérisation. La résolution de l’image doit être d’au moins 512 x 512 pixels.
- Acquérir des images du volume tumoral à différentes positions toutes les 20 min pendant 2 h. Ajouter de l’eau à l’objectif avant chaque acquisition d’image.
note: Les images Time-lapse peuvent être acquises automatiquement en réglant le bon time-lapse dans le logiciel. Cependant, la souris peut se déplacer et la position ou la pile z peut se déplacer au fil du temps, entraînant une perte de données. Par conséquent, il est recommandé d’effectuer le time-lapse manuellement et de vérifier et d’ajuster les décalages xyz entre les acquisitions.
- À cette étape, en option, photo-commutez le marqueur fluorescent Dendra2.
note: Contrairement à l’imagerie time-lapse (qui permet d’étudier les propriétés individuelles des cellules tumorales et leur évolution au fil du temps), cela permettra d’étudier la zone d’infiltration des cellules tumorales dans le cerveau sur plusieurs jours.