1. Essai d’attraction des macrophages in vitro
- Préparation des milieux conditionnés
- Réchauffez le milieu de maintenance des cellules tumorales au bain-marie à 37 °C pendant 20 min.
- Vaporisez la surface de la hotte de culture tissulaire avec de l’éthanol à 70 % et essuyez l’éthanol à 70 % sur la surface avec des serviettes en papier. Prenez la solution de détachement cellulaire du réfrigérateur. Vaporisez les flacons du milieu et de la solution de détachement cellulaire avec de l’éthanol à 70 %, essuyez l’éthanol à 70 % sur la surface avec des serviettes en papier et amenez-les dans le capot de culture tissulaire.
- Sortez les plaques à 6 puits de l’incubateur. Pipeter soigneusement le milieu conditionné dans des tubes à centrifuger stériles de 15 ml. Mettez les tubes sur de la glace. Pipeter le milieu dans le puits « milieu uniquement » dans un tube à centrifuger stérile séparé de 15 ml.
REMARQUE : Avant cette étape, assurez-vous de vérifier au microscope si les cellules se fixent. Sinon, on peut utiliser des plaques revêtues pour permettre une meilleure fixation ou inclure les cellules flottantes dans l’étape de comptage.
- Ajouter 0,5 mL de solution de détachement cellulaire dans chaque puits de la plaque à 6 puits. Vérifiez si les cellules tumorales s’arrondissent toutes les minutes. Une fois que les cellules tumorales se rassemblent, tapotez doucement le côté de la plaque pour aider les cellules à se détacher.
- Pipetez 2,5 ml de milieu de maintenance des cellules tumorales dans le puits, pipetez de haut en bas 3 fois pour mélanger et transférez les cellules dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml. Prélever 10 μL des cellules et mélanger avec 10 μL de solution de Trypan Blue. Pipeter 10 μL du mélange dans la lame de comptage et quantifier le nombre de cellules vivantes à l’aide d’un compteur de cellules automatique.
- Ajustez le volume du milieu conditionné en fonction du nombre de cellules à l’aide du milieu de cellules souches sans sérum (incubation à 37 °C pendant la nuit). Par exemple, si le puits A a 3 fois plus de cellules vivantes que le puits avec le moins de cellules, diluez son milieu conditionné 1:3. Cette étape permet de contrôler la différence causée par le taux de prolifération cellulaire.
note: La raison d’utiliser un milieu exempt de cellules souches sériques avec une incubation à 37 °C pendant la nuit est de contrôler le changement possible dans le milieu avec une exposition prolongée à 37 °C.
- Filtrez le média conditionné à l’aide de filtres de 0,45 μm. Mettez le média conditionné sur ice.
REMARQUE : Cette étape élimine les cellules et les débris cellulaires dans le milieu conditionné.
2. Préparation des cellules MV-4-11
- Réchauffez le milieu IMDM (sans FBS) au bain-marie à 37 °C pendant 20 min.
- Vaporisez la surface de la hotte de culture tissulaire avec de l’éthanol à 70 % et essuyez l’éthanol à 70 % sur la surface avec des serviettes en papier. Vaporisez le flacon moyen avec de l’éthanol à 70 %, essuyez l’éthanol à 70 % sur la surface avec des serviettes en papier et apportez-les dans le capot de culture tissulaire.
- Introduire le flacon de cellules MV-4-11 dans le capuchon de culture tissulaire. Pipeter 10 ml de cellules dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml. Prélever 10 μL de cellules et mélanger avec 10 μL de solution de Trypan Blue. Pipeter 10 μL du mélange dans la lame de comptage et quantifier le nombre de cellules vivantes à l’aide d’un compteur de cellules automatique. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer le surnageant.
- Laver les cellules avec 10 mL de PBS et centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer le surnageant.
- Remettre les cellules en suspension dans un milieu IMDM (sans FBS) pour une densité cellulaire finale de 1x106 cellules/mL.
REMARQUE : Le nombre de cellules des macrophages utilisés ici peut être ajusté.
3. Dosage Transwell
REMARQUE : Pour cette étape, utilisez un kit de test de migration cellulaire ou achetez les réactifs et insérez-les séparément. Pour les cellules MV-4-11, choisissez des inserts Transwell avec des pores de 5 μm. Pour détecter la migration des macrophages, quantifiez directement le nombre de macrophages dans la chambre inférieure ou utilisez des méthodes colorimétriques/fluorimétriques. Ici, nous démontrons le dosage à l’aide de la méthode colorimétrique.
- Amenez la plaque à 24 puits, l’insert et les réactifs à température ambiante.
- Ajouter 250 μL de cellules MV-4-11 préparées ci-dessus dans chaque insert.
- Ajouter 400 μL de milieu conditionné/milieu seulement (avec incubation pendant la nuit à 37 °C, ces échantillons servent de témoin négatif) dans les chambres inférieures de la plaque à 24 puits. Pour chaque ligne tumorale ou contrôle, utilisez des échantillons en trois exemplaires. Évitez les bulles entre l’insert et le fluide conditionné. Les bulles empêcheront les macrophages de migrer vers les puits de fond.
- Incuber les plaques dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 4 h
REMARQUE : Le temps d’incubation peut être ajusté. Les cellules migrant dans les chambres inférieures peuvent être observées au microscope.
- Tapotez doucement l’insert sur la paroi intérieure du même puits et jetez l’insert. Comme les cellules MV-4-11 se développent en suspension, une solution de détachement cellulaire ou un traitement à la trypsine n’est pas nécessaire ici.
- Pipetez doucement les cellules dans les puits de haut en bas 3 fois pour mélanger. Transférez 225 μL de suspension cellulaire sur une plaque à 96 puits à paroi noire adaptée à la mesure fluorescente.
- Diluez le colorant CyQuant 1:75 avec un tampon de lyse 4x. Vortex brièvement et faites tourner la solution. Ajouter 75 μL de solution dans chaque puits de la plaque à 96 puits. Incuber 15 min à température ambiante.
- Lisez la fluorescence à l’aide du jeu de filtres 480/520 nm avec un lecteur de plaques de fluorescence.
- Analysez les données en soustrayant le blanc et en normalisant la lignée cellulaire de la tumeur de contrôle.
