Extraction de vésicules extracellulaires : une technique pour isoler des vésicules extracellulaires à partir d’échantillons de tissus entiers à l’aide de la centrifugation différentielle

Résumé

Source : Hurwitz, S. N. et al. Extraction de vésicules extracellulaires à partir de tissus entiers. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo décrit la technique d’extraction des vésicules extracellulaires à partir de tissus frais ou congelés. Les vésicules extracellulaires isolées peuvent être utilisées pour une analyse plus approfondie afin de découvrir leurs rôles significatifs dans la pathogenèse de la maladie.

Protocole

1. Dissociation tissulaire et centrifugation différentielle

1. Préparez 10 mL de tampon de dissociation (10 mg de papaïne ; 5,5 mM de L-cystéine ; 67 μM de 2-mercaptoéthanol ; 1,1 mM d’EDTA) dans un milieu Hibernate-E pour environ 0,4 à 1,0 g de tissu.
   REMARQUE : Toutes les solutions utilisées pour l’enrichissement et la purification des VE doivent être diluées dans de l’eau filtrée ultra-pure.
2. Ajouter des tissus entiers frais ou congelés dans un tampon de dissociation dans un tube conique de 50 mL et incuber dans un bain d’eau chaude à 37 °C pendant 20 min. Les tissus peuvent être coupés en petits fragments avant l’incubation si nécessaire.
3. Après l’incubation, ajoutez des inhibiteurs de protéase et de phosphatase pour une concentration finale de 1x au tampon de dissociation contenant le tissu.
4. Versez la solution contenant le tissu dans un homogénéisateur Dounce amovible et dissociez doucement le tissu en utilisant environ 30 coups lents par échantillon. Le nombre de coups peut être ajusté en fonction de la consistance du tissu.
5. Transférez le tissu dissocié dans un tampon dans un tube conique de 50 mL et centrifugez à 500 x g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les cellules et les fragments de tissu fibreux ou cohésif restants.
6. Transvasez le surnageant dans un tube conique propre de 50 mL et centrifugez-le à 2 000 x g pendant 10 min à 4 °C pour le faire granuler et jeter les gros débris cellulaires.
7. Transférez à nouveau le surnageant dans un tube conique propre de 50 mL et centrifugez-le à 10 000 x g pendant 40 min à 4 °C pour réduire en granules les grandes vésicules indésirables ou les petits corps apoptotiques.
   REMARQUE : Cette pastille peut être conservée pour une étude supplémentaire de vésicules plus grandes si vous le souhaitez.
8. Décantez le surnageant à travers un filtre de 0,45 μm dans un tube d’ultracentrifugation propre de 12 mL.
   note: Les échantillons de tissus densément fibreux peuvent ne pas être facilement filtrés. Ces échantillons peuvent être filtrés à travers une crépine cellulaire de 40 μm, puis passés à travers des aiguilles plus petites en série (18 G, 20 G, 22 G) avant d’être filtrés à travers le filtre de 0,45 μm.
9. Ultracentrifuger l’échantillon à 100 000 x g pendant 2 h à 4 °C pour granuler de petits VE.
10. Décanter le surnageant et laisser les tubes d’ultracentrifugation inversés pendant 5 à 10 min, en tapotant fréquemment pour éliminer le liquide résiduel sur les côtés des tubes. Le liquide résiduel peut également être aspiré à l’aide d’une pipette à vide aspirante.
11. Remettre en suspension la pastille EV dans 1,5 mL de tampon de saccharose 0,25 M (10 mM Tris, pH 7,4). Il est important d’assurer la remise en suspension complète du granulé à cette étape. Pour ce faire, couvrez les tubes avec du parafilm avant de mettre les VE en solution. Secouez les tubes de l’ultracentrifugeuse pendant 15 à 20 minutes à température ambiante avant un mélange final au vortex.
12. Centrifugez brièvement les tubes à une vitesse ne dépassant pas 1 000 x g pour récupérer la suspension liquide au fond du tube.
13. Passez aux étapes de purification du gradient ci-dessous ou, si nécessaire, stockez la suspension EV à 4 °C pendant la nuit.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Filtre 0,45 μm	VWR	Référence 28145-505
Tubes d’ultracentrifugation de 12 mL	Beckman Coulter	331372
Tubes à ultracentrifuger de 5,5 ml	Beckman Coulter	344057
Inhibiteur de la phosphatase HALT (solution 100x)	ThermoFisher Scientific	Référence 78420
Inhibiteur de la protéase HALT (solution 100x)	ThermoFisher Scientific	Référence 78438
Hibernation E medium	ThermoFisher Scientific	A1247601
Rotor à godet oscillant MLS-50	Beckman Coulter	Référence 367280
Ultracentrifugeuse de paillasse Optima MAX-XP	Beckman Coulter	393315