Purification de sous-populations de vésicules extracellulaires : une technique pour purifier des sous-populations de vésicules extracellulaires à l’aide de l’ultracentrifugation à gradient de densité

Résumé

Source : Urwitz, S. N. et al. Extraction de vésicules extracellulaires à partir de tissus entiers. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo démontre la méthode de purification basée sur l’ultracentrifugation à gradient de densité pour isoler des sous-populations de vésicules extracellulaires adaptées aux études de caractérisation.

Protocole

1. Purification du gradient de densité

1. Ajouter 1,5 mL d’iodixanol à 60 % (solution mère dans l’eau) au tampon de 1,5 mL de saccharose/Tris contenant des VE pour créer une solution finale contenant 30 % d’iodixanol. Pipetez de haut en bas plusieurs fois pour bien mélanger la solution.
   note: Veillez à ne pas perdre de solution dans l’embout de la pipette, car la concentration élevée d’iodixanol est assez visqueuse.
2. Transférez la solution tampon d’iodixanol à 30 % contenant des VE au fond d’un tube d’ultracentrifugation de 5,5 ml.
3. Préparer au moins 1,5 mL de solutions d’iodixanol à 20 % et à 10 % par échantillon dans de l’eau ultrapure à partir de la solution mère d’iodixanol à 60 %.
4. Mesurer 1,3 mL d’iodixanol à 20 % et superposer soigneusement la couche inférieure à l’aide d’une seringue et d’une aiguille de 18 G. Pour éviter de mélanger les couches à l’interface de densité, maintenez le biseau de l’aiguille en contact avec l’intérieur du tube d’ultracentrifugation juste au-dessus du ménisque et ajoutez la solution goutte à goutte.
5. Appliquer une couche de 1,2 mL de solution d’iodixanol à 10 % sur la couche d’iodixanol à 20 % en utilisant la même technique que ci-dessus.
6. Équilibrez et chargez soigneusement les tubes d’ultracentrifugation dans les godets du rotor et la centrifugeuse dans un rotor à godets oscillants à 268 000 x g pendant 50 min à 4 °C. Réglez les vitesses d’accélération et de décélération de la centrifugeuse aux vitesses minimales autorisées pour éviter de perturber les couches de densité.
7. Étiquetez dix tubes de microcentrifugation de 1,5 mL pour chaque échantillon afin qu’ils correspondent aux fractions 1 à 10 des gradients de densité. La fraction 1 est désignée comme la fraction la plus élevée qui sera retirée en premier, tandis que la fraction 10 est la fraction inférieure retirée en dernier.
8. Une fois l’ultracentrifugation à gradient terminée, retirez délicatement les tubes des godets du rotor et placez-les dans un support stable. Une bande visible de vésicules sera souvent observée dans la fraction d’intérêt. Pipetez dix fractions en série de 490 μL à partir du haut du gradient dans les tubes correspondants. Il restera une petite quantité de liquide au fond du tube qui contient probablement des protéines contaminantes. Cet échantillon peut être jeté ou conservé sous forme de fraction 11, si vous le souhaitez.
9. Mesurez les indices de réfraction des fractions à l’aide d’un réfractomètre. Cela peut également être effectué avec un gradient de contrôle exécuté en parallèle si la conservation de l’échantillon est nécessaire. Pipeter 20 à 30 μL de chaque fraction contenant de l’iodixanol sur la surface du réfractomètre et estimer la masse volumique en comparant les indices de réfraction aux densités connues de l’iodixanol.
   note: Les fractions peuvent être stockées toute la nuit dans la solution contenant de l’iodixanol si nécessaire avant de passer à l’étape suivante de lavage par ultracentrifugation.
10. Transférez chaque fraction dans un tube d’ultracentrifugation propre de 12 ml. Ajouter 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, pH 7,4) dans le tube et mélanger en pipetant lentement de haut en bas.
    REMARQUE : Le PBS ajouté aux échantillons doit être exempt de particules, c’est-à-dire en filtrant le PBS stérile à travers un filtre de 0,22 μm et en le stockant à température ambiante pour éviter la précipitation du sel.
11. Ajoutez 6 ml supplémentaires de 1x PBS sur le dessus et mélangez à nouveau soigneusement.
12. Ultracentrifuger les tubes à 100 000 x g pendant 2 h à 4 °C pour ré-granuler les petites vésicules. Décantez le surnageant et séchez les tubes avant la lyse des vésicules pour l’analyse des protéines ou la remise en suspension des VE pour l’analyse morphologique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Filtre 0,45 μm	VWR	Référence 28145-505
Tubes d’ultracentrifugation de 12 mL	Beckman Coulter	331372
Tubes à ultracentrifuger de 5,5 ml	Beckman Coulter	344057
Rotor FA-45-6-30	Eppendorf	5820715006
Rotor à godet oscillant MLS-50	Beckman Coulter	Référence 367280
Ultracentrifugeuse de paillasse Optima MAX-XP	Beckman Coulter	393315
Ultracentrifugeuse Optima XE-100	Beckman Coulter	N° A94516
Optiprep	sigma	D1556	Iodixanol à 60 % dans une solution d’eau stérile
Refracto 30PX (réfractomètre)	Mettler Toledo	51324650
Rotor S-4-104	Eppendorf	5820759003
SW 41 Ti Rotor à godet oscillant	Beckman Coulter	Référence 333790
Centrifugeuse de table 5804R	Eppendorf	22623508