Génération de cellules souches neurales induites (iNSC) à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMNC) : une procédure basée sur le virus Sendai pour reprogrammer les PBMNC en iNSCs

Résumé

Source : Zheng, W. et al. Génération de cellules souches neurales induites à partir de cellules mononucléées périphériques et différenciation vers les précurseurs de neurones dopaminergiques pour les études de transplantation.J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre la reprogrammation de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMNC) en cellules souches neurales induites (iNSC) à l’aide du virus Sendai. Le virus Sendai est un virus non intégrateur qui offre un véhicule efficace et sûr pour reprogrammer les cellules.

Protocole

1. Reprogrammation des PBMNCs en iNSCs par infection par SeV

1. Préparation de la solution et du milieu de culture
   1. Préparez une solution mère de poly-D-lysine (PDL) en dissolvant 100 mg de PDL avec 100 mL de H₂O à une concentration de 1 mg/mL. Conserver à -20 °C dans des aliquotes de 1 mL.
   2. Préparez une solution mère d’insuline en dissolvant 100 mg d’insuline dans 20 ml de HCl 0,01 N jusqu’à une concentration de 5 mg/mL. Conserver à -20 °C dans des aliquotes de 1 mL.
   3. Pour préparer 200 mL de milieu de base iNSC, combinez 96 mL de DMEM-F12 et 96 mL de milieu basique (Table des matières) avec 2 mL de solution mère de glutamine 100x, 2 mL d’acide aminé non essentiel (NEAA), 2 mL de supplément N2 et 2 mL de supplément B27. Ajouter 10 ng/mL de facteur inhibiteur de la leucémie humaine recombinante, 3 μM CHIR99021 et 2 μM SB431542 avant l’utilisation. Filtrez le fluide et rangez-le à 4 °C
      note: Utilisez le milieu dans les 2 semaines. Ajouter le facteur inhibiteur de la leucémie humaine recombinante, CHIR99021 et SB431542 immédiatement avant l’utilisation.
2. Reprogrammation des PBMNCs en iNSC par infection par SeV
   1. Stérilisez aux ultraviolets un banc propre avant de l’utiliser. Stérilisez toutes les surfaces et l’équipement avec de l’alcool à 75 %. Stérilisez tous les embouts à l’aide d’un autoclave.
   2. Le jour 0, prélever les cellules dans un milieu MNC et les transférer dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min. Aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension avec 1 mL de milieu MNC préchauffé.
   3. Comptez les cellules viables avec du bleu trypan. Remettre les cellules en suspension avec un milieu MNC préchauffé (37 °C) à une concentration de 2 x 10⁵ cellules par puits dans des plaques à 24 puits.
   4. Après avoir retiré les tubes SeV de l’entreposage à -80 °C, décongelez les tubes contenant du SeV dans un bain-marie à 37 °C pendant 5 à 10 s, puis laissez-les décongeler à RT. Une fois décongelés, placez-les immédiatement sur de la glace.
   5. Ajoutez le SeV codant pour l’humain Klf4, Oct3/4, SOX2 et c-MyC dans les puits, à une multiplicité d’infection (MOI) de 10. Cellules de centrifugation avec plaques à 1 000 x g pendant 30 min pour faciliter la fixation des cellules. Laissez les cellules et le surnageant dans les plaques. Placez les plaques dans l’incubateur à 37 °C, 5 % CO₂.
      ATTENTION : Toutes les procédures impliquant le SeV doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité, et tous les embouts et tubes doivent être traités avec de l’éthanol ou de l’eau de Javel avant d’être éliminés.
   6. Le jour 1, transférez le milieu et les cellules dans un tube à centrifuger de 15 ml. Rincez le puits avec 1 mL de milieu MNC. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension avec 500 μL de milieu MNC frais préchauffé dans des plaques à 24 puits.
      note: Utilisez une plaque à 24 puits à faible fixation pour empêcher la fixation de cellules avant le placage sur PDL/laminine.
   7. Le jour 2, diluer 1 mL de DEL à 1 mg/mL avec 19 mL de D-PBS à une concentration de 50 μg/mL. Enduire les plaques à 6 puits d’une quantité de PDL de 50 μg/mL pendant au moins 2 h à RT.
   8. Diluer 200 μL de laminine à 0,5 mg/mL avec 20 mL de D-PBS à une concentration de 5 μg/mL. Aspirez le PDL dans les plaques à 6 puits et séchez-le sur le banc de nettoyage vertical.
   9. Enduire les plaques à 6 puits de laminine de 5 μg/mL et incuber pendant 4 à 6 h à 37 °C. Laver avec du D-PBS avant utilisation.
   10. Le jour 3, plaquez les cellules transduites obtenues à l’étape 1.2.6 en milieu iNSC sur des plaques à 6 puits recouvertes de PDL/laminine.
       note: Déplacez doucement les plaques si nécessaire après que les cellules ont été placées sur des plaques recouvertes de PDL / laminine, en essayant de ne pas perturber la fixation des cellules.
   11. Le jour 5, ajouter doucement 1 mL de milieu iNSC préchauffé (37 °C) dans chaque puits dans des assiettes à 6 puits.
       note: On s’attend à ce que les cellules subissent une mort drastique (>60 %).
   12. Le 7e jour, ajouter doucement 1 mL de milieu iNSC préchauffé (37 °C) dans chaque puits dans des assiettes à 6 puits.
   13. Du jour 9 au jour 28, remplacez chaque jour le milieu épuisé par un milieu iNSC frais préchauffé (37 °C). Surveiller l’émergence des colonies d’iNSC. Choisissez et transférez des clones iNSC pour une expansion dans environ 2 à 3 semaines. Prélever les colonies avec la morphologie appropriée à l’aide de pipettes en verre brûlé, à l’exclusion de toute cellule susceptible de contaminer, et aspirer les colonies avec des pointes de 200 μL.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Supplément B27	Invitrogen	17504044
CHIR99021	Opération des gènes	Référence 04-0004
DMEM-F12	Gibco	Référence 11330
DMEM-F12	Gibco	Référence 11320
Laminine	Roche	11243217001
Supplément N2	Invitrogen	17502048
NEAA	Invitrogen	11140050	Acide aminé non essentiel
Neurobasale	Gibco	Référence 10888	Média de base
Pdl	Sigma-Aldrich	P7280	Poly-D-lysine
SB431542	Opération des gènes	04-0010-10mg	Stocker à l’abri de la lumière à -20 ?
Virus Sendai	Technologies de la vie	MAN0009378
insuline	Roche	12585014
Plaque à 24 puits	Corning	Référence 3337
Tube conique de 15 ml	Corning	430052
Plaque à 6 puits	Corning	Référence 3516
L’EPO	Peprotech	Référence 100-64-50UG	Érythropoïétine humaine
Facteur inhibiteur de la leucémie humaine	Millpore	LIF1010
SCF recombinant humain	Peprotech	Référence 300-07-100UG
L’IGF-1	Peprotech	100-11-100UG	Facteur de croissance analogue à l’insuline humaine
L’IL-3	Peprotech	Référence 200-03-10UG	Interleukine humaine 3
dexaméthasone	Sigma-Aldrich	D2915-100MG
IMDM	Gibco	Référence 215056-023	médium Dulbecco modifié d'Iscove
insuline	Roche	12585014
ITS-X	Invitrogen	Référence 51500-056	Supplément insuline-transferrine-sélénium-X
GlutaMAX	Invitrogen	21051024	100 × de solution mère de glutamine
Jambon-F12	Gibco	Référence 11765-054
1-Thioglycérol	Sigma-Aldrich	Référence M6145	Toxique par inhalation et par contact avec la peau
acide ascorbique	Sigma-Aldrich	N° A92902	Toxique en cas de contact avec la peau
Remplacement du sérum knockout	Gibco	10828028	Milieu basal libre de sérum
Concentré de lipides chimiquement définis	Invitrogen	11905031
Transferrine	Systèmes de R&D	Référence 2914-HT-100G
Trypan bleu	Gibco	Réf. T10282

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