Isolement de l’ADN libre circulant (cfDNA) : une procédure membranaire à base de silice pour extraire l’ADNcf du plasma sanguin de patients atteints de cancer

Résumé

Source : Palande, V. et al. Détection d’ADN acellulaire dans des échantillons de plasma sanguin de patients atteints de cancer. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo décrit une procédure de membrane à base de silice pour isoler de l’ADN acellulaire circulant ou de l’ADNcf à partir d’un échantillon de plasma humain. L’ADNcf est un biomarqueur prometteur pour le diagnostic et l’évaluation du cancer.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.

1. Purification de l’ADNcf circulant à partir de 1 mL de plasma

REMARQUE : Cette étape est effectuée avec un kit commercial (voir Tableau des matériaux). Tous les tampons sont fournis avec le kit.

1. Préparation des tampons et réactifs
   prudence: N’ajoutez pas de solutions acides ou d’eau de Javel directement aux déchets de préparation des échantillons. Les sels de guanidine présents dans le tampon de lyse, le tampon de liaison et le tampon de lavage-1, lorsqu’ils sont combinés avec de l’eau de Javel ou des acides, peuvent produire des composés hautement réactifs.
   1. Tampon de liaison : Mélangez 300 ml de concentré de tampon de liaison avec 200 ml d’isopropanol à 100 % pour obtenir 500 ml de tampon de liaison fonctionnel. Conserver à température ambiante.
      note: Le tampon de liaison permet la liaison optimale des acides nucléiques circulants à la membrane de silice. 500 ml de tampon de liaison sont suffisants pour traiter 276, 138, 92, 69 ou 55 échantillons de 1, 2, 3, 4 ou 5 ml de plasma respectivement et sont stables pendant 1 an à température ambiante.
   2. Tampon de lavage-1 : Mélangez 19 ml de concentré Tampon de lavage-1 avec 25 ml d’éthanol 96-100 % pour obtenir 44 ml de tampon de lavage-1 fonctionnel. Conserver à température ambiante.
      note: Wash Buffer-1 élimine les contaminants liés à la membrane de silice. 44 mL de tampon de lavage-1 sont suffisants pour traiter 73 échantillons de 1/2/3/4/5 mL de plasma et sont stables pendant 1 an à température ambiante.
   3. Tampon de lavage-2 : Mélangez bien 13 ml de concentré Wash Buffer-2 avec 30 ml d’éthanol à 96-100 % pour obtenir 43 ml de tampon de lavage 2 fonctionnel. Conserver à température ambiante.
      note: Wash Buffer-2 élimine les contaminants liés à la membrane de silice. 43 mL de tampon de lavage-2 sont suffisants pour traiter ~56 échantillons de 1/2/3/4/5 mL de plasma et sont stables pendant 1 an à température ambiante.
   4. Dans un tube contenant 310 μg d’ARN porteur lyophilisé, ajouter 1 550 μL de tampon d’élution, pour préparer une solution d’ARN porteur de 0,2 μg/μL. Après avoir complètement dissous l’ARN porteur, divisez la solution en aliquotes appropriées et conservez-la entre -30 °C et -15 °C. Ne congelez pas ces aliquotes plus de 3 fois. Au tampon de lyse, comme indiqué dans le tableau 1, ajoutez l’ARN porteur reconstitué dissous dans le tampon d’élution.
      note: Étant donné que l’ARN porteur ne se dissout pas directement dans le tampon de lyse, il doit être dissous d’abord dans un tampon d’élution, puis dans le tampon de lyse. Tout d’abord, la liaison entre la membrane de silice et les acides nucléiques est renforcée lorsqu’il y a très peu de molécules cibles présentes dans l’échantillon. Deuxièmement, le risque de dégradation de l’ARN est réduit en raison de la présence de grandes quantités d’ARN porteur.
2. Avant de commencer l’isolement, amenez les colonnes et les échantillons à température ambiante et ajustez les volumes d’échantillon à 1 mL avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS), si nécessaire. Préchauffez 2 bains-marie ou blocs chauffants contenant des tubes à centrifuger de 50 ml et des tubes de collecte de 2 ml à 60 °C et 56 °C, respectivement.
3. Dans un tube à centrifuger de 50 mL, ajouter 100 μL de protéinase K, 1 mL de plasma et 0,8 mL de tampon de lyse contenant 1,0 μg d’ARN porteur (préparé à l’étape 1.1.4). Fermez le tube de centrifugation à l’aide d’un capuchon et mélangez le contenu par vortex pulsé pendant 30 s, tout en assurant un vortex visible dans le tube. Un mélange minutieux du contenu est important pour une lyse efficace.
   note: Immédiatement après le vortex, passez à l’étape 1.4, sans délai.
4. Incuber la solution à 60 °C pendant 30 min.
5. Retirez le bouchon, ajoutez 1,8 mL de tampon de liaison dans le tube et mélangez soigneusement avec un vortex d’impulsions pendant 15 à 30 s après avoir placé le bouchon.
6. Incuber le mélange obtenu pendant 5 minutes sur de la glace et insérer la colonne à membrane de silice dans l’appareil à vide relié à la pompe à vide. Ensuite, insérez fermement une rallonge de tube de 20 ml dans la colonne ouverte pour éviter les fuites d’échantillon.
7. Versez délicatement le mélange incubé dans la rallonge de tube de la colonne et allumez la pompe à vide. Une fois que tout le mélange de lysat a complètement coulé à travers les colonnes, éteignez la pompe à vide, relâchez la pression à 0 mbar, puis retirez et jetez le prolongateur de tube.
   note: Pour éviter la contamination croisée, la rallonge de tube doit être jetée avec précaution, afin d’éviter qu’elle ne se propage sur les colonnes adjacentes.
8. Retirer la colonne de l’appareil à vide, l’insérer dans le tube collecteur et centrifuger à 11 000 x g pendant 30 s à température ambiante, pour éliminer tout lysat résiduel. Jetez le flux continu.
9. Ajouter 600 μL de tampon de lavage-1 dans la colonne, centrifuger à 11 000 x g pendant 1 min à température ambiante, jeter le flux.
10. Ajoutez 750 μL de tampon de lavage-2 dans la colonne, centrifugez à 11 000 x g pendant 1 min à température ambiante et jetez le flux.
11. Ajouter 750 μL d’éthanol (96 à 100 %) dans la colonne, centrifuger à 11 000 x g pendant 1 min à température ambiante et jeter le flux.
12. Centrifugez la colonne à 20 000 x g pendant 3 min, en la plaçant dans un tube de prélèvement propre de 2 mL.
13. Séchez complètement la colonne à membrane en la plaçant dans un nouveau tube de collecte de 2 mL avec le couvercle ouvert et l’incubation à 56 °C pendant 10 min.
14. Placez la colonne dans un tube d’élution propre de 1,5 ml. Au centre de la membrane de la colonne, appliquez 20 à 150 μL de tampon d’élution et incubez à température ambiante pendant 3 minutes avec le couvercle fermé.
    note: Assurez-vous que le tampon d’élution est équilibré à la température ambiante. En cas d’utilisation d’un tampon d’élution inférieur à 50 μL, assurez-vous qu’il est distribué soigneusement au centre de la membrane. Cela aide à l’élution complète de l’ADN lié. Cependant, le volume d’élution n’est pas fixe et peut être modifié en fonction des applications en aval. L’éluat récupéré peut atteindre 5 μL et certainement moins que le volume d’élution appliqué à la colonne.
15. Centrifuger l’éluat récupéré dans une microcentrifugeuse à 20 000 x g pendant 1 min pour éluer les acides nucléiques, et stocker à -20 °C.

Numéro d’échantillon	Tampon de lyse (mL)	ARN porteur dans le tampon d’élution (μL)
1	0,9	5.6
deux	1.8	11.3
3	2.6	16,9
4	3.5	22,5
5	4.4	28,1
6	5.3	33,8
7	6.2	39,4
8	7	45
9	7,9	50,6
10	8.8	56,3
11	9,7	61,9
12	10.6	67,5
13	11.4	73,1
14	12.3	78,8
15	13.2	84,4
16	14.1	90
17	15	95,6
18	15,8	101.3
19	16,7	106,9
20	17,6	112,5
21	18,5	118,1
22	19,4	123,8
23	20,2	129,4
24	21,1	135

Tableau 1. Volumes de tampon de lyse et d’ARN porteur (dissous dans le tampon d’élution) nécessaires au traitement d’échantillons de plasma de 1 mL.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit d’ADN haute sensibilité Agilent	Agilent Technologies, Inc.	Référence 5067-4626	Les tests d’ADN à haute sensibilité sont souvent utilisés pour le contrôle de la qualité des échantillons des banques de séquençage de nouvelle génération.
Tubes de conservation cf-DNA/cf-RNA	Norgen Biotek Corp.	Référence 63950	Les tubes de conservation cf-DNA/cf-RNA de Norgen sont des tubes en plastique fermés et sous vide pour la collecte et la préservation de l'ADNcf, de l'ADN tumoral circulant, de l'ARNcf et des cellules tumorales circulantes dans les échantillons de sang total humain pendant le stockage et l'expédition
Kit d’acides nucléiques circulants QIAamp	Qiagen	Référence 55114	Le kit d’acides nucléiques circulants QIAamp permet une purification efficace de ces acides nucléiques circulants à partir de plasma ou de sérum humain et d’autres fluides corporels acellulaires.
Collecteur à vide QIAvac 24 Plus	Qiagen	Référence 19413	Le collecteur à vide QIAvac 24 Plus est conçu pour le traitement sous vide des colonnes QIAGEN en parallèle.
Système de connexion QIAvac	Qiagen	Référence 19419	En combinaison avec le système de raccordement QIAvac, le collecteur d’aspiration QIAvac 24 Plus peut être utilisé comme système à flux continu. Le flux d’échantillons, contenant des matières potentiellement infectieuses, est collecté dans une bouteille de déchets séparée.
Système de connexion QIAvac	Qiagen	Référence 19419	En combinaison avec le système de raccordement QIAvac, le collecteur d’aspiration QIAvac 24 Plus peut être utilisé comme système à flux continu. Le flux d’échantillons, contenant des matières potentiellement infectieuses, est collecté dans une bouteille de déchets séparée.
divers
Tubes à centrifuger de 50 mL
Glace pilée
Éthanol (96 à 100 %)
Bloc chauffant ou similaire à 56 °C (capable de contenir des tubes de prélèvement de 2 ml)
Isopropanol (100 %)
Microcentrifugeuse
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
Pipettes (réglables)
Pointes de pipette stériles (les pointes de pipette avec barrières anti-aérosols sont recommandées pour aider à prévenir la contamination croisée)
Bain-marie ou bloc chauffant capable de contenir des tubes de centrifugation de 50 mL à 60 °C