Analyse automatisée de la distribution de la taille des fragments d’ADN de cf basée sur l’électrophorèse capillaire : une méthode basée sur une micropuce d’ADN pour étudier la distribution de la taille de fragments d’ADN isolés à partir de biofluides

Résumé

Source : Palande, V. et al. Détection d’ADN acellulaire dans des échantillons de plasma sanguin de patients atteints de cancer. J. Vis. Exp. (2020)

Dans cette vidéo, nous analysons la distribution granulométrique de fragments d’ADN acellulaire ou d’ADNcf à l’aide de l’électrophorèse capillaire automatisée. Cette technique permet de mieux comprendre le profil des fragments d’ADN libérés par les cellules cancéreuses lors de l’apoptose.

Protocole

1. Distribution de la taille des fragments d’ADN cfDNA par analyseur de fragments

1. L’étape avant de commencer la procédure : Équilibrez le concentré de colorant d’ADN et la matrice de gel d’ADN à température ambiante pendant 30 min.
2. Préparation du mélange gel-colorant
   note: Manipulez les solutions avec prudence car le DMSO est connu pour faciliter l’entrée des molécules organiques dans les tissus.
   1. Décongelez complètement le DMSO en faisant un vortex dans le flacon de concentré de colorant d’ADN pendant 10 s. Pipetez 15 μL de ce concentré dans un flacon de matrice de gel d’ADN et conservez-le à 4 °C dans l’obscurité.
   2. Encore une fois, faites tourbillonner le flacon bouché pendant 10 s jusqu’à ce que le mélange du gel et du colorant soit visualisé.
   3. Versez le mélange sur un filtre rotatif dans la prise supérieure.
   4. Microcentrifugeuse : le filtre de spin à 2 240 x g ± 20 % pendant 10 min à température ambiante.
   5. Étiquetez le colorant gélifié préparé dans le tube et jetez le filtre, conformément aux bonnes pratiques de laboratoire. Étiquetez le tube et notez la date de préparation.
      note: Jeter le filtrat conformément aux bonnes pratiques de laboratoire. Le mélange gel-colorant peut être utilisé pour 5 puces d’ADN à haute sensibilité (HS). En cas d’inutilisation pendant plus de 1 h, conserver à 4 °C. Le stockage dans l’obscurité est possible jusqu’à 6 semaines.
3. Pour charger le mélange gel-colorant, assurez-vous de la position de la plaque de base de la station d’amorçage des copeaux et ajustez le clip à la position la plus basse.
   1. Équilibrez le mélange gel-colorant à température ambiante pendant 30 min, tout en surveillant l’exposition à la lumière.
   2. Prenez une nouvelle puce d'ADN HS dans un sac scellé et placez-la sur la station d'amorçage de la puce, puis retirez 9,0 μL du mélange gel-colorant et distribuez-le au fond du puits de la puce, marqué « G ».
      note: Prélevez le mélange gel-colorant en évitant les particules qui pourraient s’accumuler au fond du flacon. Tout en distribuant le mélange gel-colorant dans le puits de la puce d’ADN HS, insérez complètement la pointe de la pipette pour éviter la formation de grosses bulles d’air. De plus, toucher la pipette sur les bords du puits donnera de mauvais résultats.
   3. Positionnez le piston à 1 mL et fermez la station d’amorçage des copeaux. Assurez-vous que le verrouillage des clics de verrouillage et réglez la minuterie sur 60 s, puis appuyez sur le piston jusqu’à ce qu’il soit maintenu par le clip, et exactement après 60 s, relâchez le piston avec le mécanisme de déverrouillage du clip.
   4. Lorsque le piston recule d'au moins 0,3 ml, attendez 5 s, puis ramenez lentement à la position 1 ml, puis ouvrez la station d'amorçage de la puce et retirez à nouveau 9,0 μL du mélange gel-colorant et distribuez au bas du puits de la puce d'ADN HS, marqué « G ».
4. Pour charger le marqueur d’ADN, versez 5 μL du marqueur d’ADN dans le puits, marqué du symbole de l’échelle. Répétez la procédure pour les 11 puits d’échantillon.
5. Pour charger l’échelle et les échantillons, distribuez 1 μL de l’échelle d’ADN dans le puits, marquée du symbole de l’échelle, puis ajoutez 1 μL d’échantillon (puits utilisés) ou 1 μL de marqueur (puits inutilisés) dans les 11 puits d’échantillons.
6. Vortex la puce HS DNA pendant 60 s à 2 400 tr/min en plaçant la puce horizontalement dans l’adaptateur. Assurez-vous que le renflement qui fixe la puce d’ADN HS n’est pas endommagé pendant le vortex.
7. Pour insérer la puce d'ADN HS dans l'instrument d'analyse de fragments, ouvrez le couvercle et assurez-vous que la cartouche d'électrode est correctement insérée et que le sélecteur de puce est positionné sur « dsHigh Sensitivity DNA » dans l'instrument d'analyse de fragments.
8. Montez soigneusement la puce d’ADN HS dans le réceptacle, qui ne s’adapte que dans un seul sens, puis fermez le couvercle en vous assurant que la cartouche d’électrode s’insère exactement dans les puits de la puce d’ADN HS.
9. L’affichage sur l’écran du logiciel de l’analyseur de fragments indique la puce d’ADN HS insérée et le couvercle fermé grâce à l’icône de la puce en haut à gauche de l’écran.
10. Pour lancer l'exécution de la puce HS DNA, sélectionnez le test d'ADNdb haute sensibilité dans le menu « Dosage » sur l'écran de l'instrument, puis remplissez correctement le tableau des noms d'échantillons en fournissant des informations telles que les noms d'échantillons et les commentaires, puis démarrez l'analyse de la puce en cliquant sur le bouton « Démarrer » en haut à droite de l'écran.
11. Nettoyage des électrodes après une analyse de puce à ADN HS : Retirez immédiatement la puce à ADN HS usagée dès que le test est terminé et jetez-la conformément aux bonnes pratiques de laboratoire. Effectuez la procédure suivante pour vous assurer que les électrodes sont propres, sans résidus restants du test précédent.
    1. Remplissez lentement 350 μL d’eau d’analyse désionisée dans l’un des puits de nettoyant d’électrode et placez le nettoyant d’électrode dans l’instrument d’analyse de fragments en ouvrant le couvercle, puis fermez le couvercle et attendez environ 10 s.
    2. Retirez le nettoyant pour électrodes en ouvrant le couvercle et attendez encore 10 secondes pour que l’eau sur les électrodes s’évapore avant de fermer le couvercle.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2100 Instrument de bioanalyse	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	Le système de bioanalyseur 2100 est un outil d’électrophorèse automatisé établi pour le contrôle de la qualité des échantillons de biomolécules.
Clip réglable pour station d’amorçage	Agilent Technologies, Inc.	Référence 5042-1398	Utilisé en combinaison avec une seringue pour appliquer une pression définie pour l’amorçage des puces.
Tubes de conservation cf-DNA/cf-RNA	Norgen Biotek Corp.	Référence 63950	Les tubes de conservation de l'ADNcf/ARNcf de Norgen sont des tubes en plastique fermés et sous vide pour la collecte et la préservation de l'ADN-cf, de l'ADN tumoral circulant, de l'ARNcf et des cellules tumorales circulantes dans des échantillons de sang total humain pendant le stockage et l'expédition
Station d’amorçage des copeaux	Agilent Technologies, Inc.	Référence 5065-4401	Utilisé pour charger la matrice de gel dans une puce à l’aide d’une seringue fournie avec chaque kit de test - utilisé pour les dosages d’ARN, d’ADN et de protéines. Comprend une station d’amorçage, un chronomètre et 1 pince à seringue
Kit de nettoyage d’électrodes	Agilent Technologies, Inc.	Référence 5065-9951	Empêche la contamination croisée. Élimine les contaminants bactériens ou protéiques des électrodes.
Filtres pour Gel Matrix	Agilent Technologies, Inc.	Tél. : 185-5990	Utilisé pour le mélange approprié du concentré de colorant d’ADN et de la matrice de gel d’ADN
Puce de base IKA Vortex	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Utilisé pour le mélange correct de l’échelle d’ADN et de l’échantillon d’ADN sur les puces de dosage du bioanalyseur
Tubes à centrifuger de 50 ml
Éthanol (96 à 100 %)
Bloc chauffant ou similaire à 56 °C (capable de contenir des tubes de prélèvement de 2 ml)
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
Pipettes (réglables)
Pointes de pipette stériles (les pointes de pipette avec barrières anti-aérosols sont recommandées pour aider à prévenir la contamination croisée)
Bain-marie ou bloc chauffant capable de contenir des tubes de centrifugation de 50 mL à 60 °C