Réaction en chaîne par polymérase numérique en gouttelettes : une méthode pour générer des réactions PCR de nanogouttelettes pour détecter des mutations tumorales rares

Résumé

Source : Bonner, E. R. et al. Détection et surveillance de l’ADN circulant associé à la tumeur dans les biofluides des patients. J. Vis. Exp. (2019)

Dans cette vidéo, nous présentons une procédure étape par étape pour générer des nano-gouttelettes émulsionnées afin de détecter les acides nucléiques cibles par réaction en chaîne par polymérase numérique ou dPCR.

Protocole

1. Détection et quantification de l’ADN cible à l’aide de la dPCR

1. Préparez le mélange réactionnel dPCR pour 8 puits du tube de bandelettes PCR plus 10 % supplémentaires, en ajoutant 220 μL de mélange maître de génotypage, 8,8 μL de sondes de type sauvage et de sonde mutante, 39,6 μL d’amorces avant et inverse de 10 μM et 17,6 μL d’huile stabilisatrice de gouttelettes.
2. Mélangez délicatement le mélange réactionnel dPCR en pipetant le volume total de haut en bas 10 à 20 fois. Ne pas vortex ou centrifuger après avoir ajouté de l’huile stabilisatrice de gouttelettes au mélange réactionnel.
3. Procurez-vous un tube de bandelettes PCR à 8 puits et versez 38 μL de mélange réactionnel dPCR directement dans le fond de chaque puits. Enlevez toutes les bulles à l’aide d’une pointe de pipette propre.
   REMARQUE : Les tubes de bandelettes PCR qui sont imbriqués ou étroitement emballés peuvent entraîner des charges électriques statiques, provoquant une coalescence et un signal bruyant lors de l’analyse des données dPCR. Pour éviter cela, aliquote bandelez les tubes dans des sacs à risque biologique séparés, évitez de trop emballer les sacs et empêchez les tubes de frotter ensemble.
4. Ajouter 12 μL d’échantillon d’ADN préamplifié dans les puits appropriés du tube de bandelettes de PCR. Pour le contrôle négatif, ajouter 12 μL de MB H₂O.
   REMARQUE : Analysez les échantillons d’ADNcf dans les puits répliqués. Pour le LCR, analyser au moins en double, et pour le plasma/sérum, analyser chaque échantillon en trois exemplaires.
5. Pipetez doucement le volume complet de haut en bas 10 fois pour mélanger le mélange réactionnel avec l’échantillon d’ADN.
6. Procurez-vous une nouvelle puce d’instrument génératrice de gouttelettes et pipetez tout le volume des puits 1 à 8 du tube de bandelettes PCR dans les canaux correspondants A-H de la puce. Évitez de toucher le bas des canaux avec une pointe de pipette.
7. Procurez-vous un nouveau tube de bandelette PCR propre et insérez-le dans l’instrument générateur de gouttelettes. Scannez ou saisissez manuellement l’ID de la puce d’instrument génératrice de gouttelettes dans le logiciel de l’ordinateur de l’instrument. Entrez les noms de chacun des 8 canaux. Cliquez sur Démarrez l’exécution pour commencer à déposer des échantillons.
8. Une fois la gouttelétisation terminée, retirez le tube de bandelette PCR et appliquez les capuchons de tube de bandelette.
9. Transférez le tube à bande dans un thermocycleur et équilibrez-le avec un autre tube à bande contenant 80 μL d’eau par puits.
10. Programmez les conditions de cycle thermique comme suit : 95 °C pendant 10 min ; 45 cycles de deux températures : 95 °C pendant 30 s et température de recuit pendant 2 min ; 98 °C pendant 10 min ; et maintenir à 10 °C.
    1. Réglez la vitesse de rampe sur 0,5 °C/s et réglez le volume de l’échantillon sur 80 μL.
11. Une fois le cycle thermique terminé, retirez le tube à bande et transférez-le dans l’instrument de quantification. Retirez les capuchons de bande PCR et remplacez-les par des capuchons à grande vitesse.
12. Allumez l’instrument de quantification et l’ordinateur connecté à l’aide du logiciel de l’instrument. Lancez le logiciel de l’instrument et cliquez sur Configurer une exécution.
13. Placez le tube de bandelette dans l’instrument de quantification.
14. Obtenez une nouvelle puce d’instrument de quantification et scannez ou saisissez manuellement l’ID de la puce dans l’instrument. Insérez la puce dans la machine.
15. Placez le bouclier métallique sur la puce et fermez le couvercle de l’instrument.
16. Dans le logiciel de l’ordinateur, entrez un nom pour l’exécution de la dPCR et pour chacun des 8 canaux (A–H). Sélectionnez Mode rapide (qui doit être utilisé avec des limites à haute vitesse) et cliquez sur Démarrer pour commencer la quantification.
17. Une fois la quantification terminée, retirez le bouclier métallique (pour l’conserver et le réutiliser) et jetez le tube et la puce de la bandelette PCR. Sur l’ordinateur de bord, le journal des exécutions contient les fichiers de résultats pour chaque exécution. Utilisez les fichiers .fcs de chaque échantillon à analyser avec le logiciel d’analyse.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit de consommables Raindance  ;   ;	Bio-Rad  ;	20-04411	Contient des puces d’instrument génératrices de gouttelettes, des puces d’instrument de quantification, des capuchons de bandelettes PCR, y compris des capuchons haute vitesse, et de l’huile stabilisatrice de gouttelettes
Raindance Sense Instrument  ;   ;	Bio-Rad		Instrument de quantification
Raindance Source Instrument  ;   ;	Bio-Rad		Instrument générateur de gouttelettes
RainDrop Analyst II Software	RainDance Technologies  ;		Logiciel d’analyse utilisé pour l’analyse de données
Thermomixer C  ;	Eppendorf  ;	14 285 562PM
MiniAmp Thermocycleur  ;   ;	Thermofisher Scientific	A37834
PCR 8 bouchons de tube de bandelette  ;   ;	VWR	10011-786
PCR tubes à bandelettes à 8 puits  ;   ;	Axygen	PCR-0208-C
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix  ;   ;	New England Biolabs Inc	M0494S