Préparation d’un échafaudage ensemencé par CSM : une technique pour préparer un échafaudage ensemencé de cellules souches mésenchymateuses en vue d’une implantation chirurgicale dans un modèle murin

Résumé

Source : Sheets, K. T. et al. Résection guidée par l’image du glioblastome et implantation intracrânienne d’échafaudages thérapeutiques ensemencés de cellules souches. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo décrit la technique d’ensemencement de cellules souches mésenchymateuses (CSM) sur un échafaudage biodégradable en poly(acide lactique) (PLA). Les échafaudages préparés peuvent être implantés dans la cavité de résection chirurgicale du cerveau d’où ils peuvent migrer vers des foyers tumoraux. De plus, ces cellules peuvent être modifiées pour exprimer des protéines thérapeutiques afin de stimuler l’apoptose dans les cellules cancéreuses.

Protocole

1. Culture cellulaire et préparation d’échafaudage

REMARQUE : Les échafaudages doivent être préparés 48 h avant l’implantation chez la souris. Les volumes suivants sont fournis par échafaudage. Multipliez les quantités au besoin pour des échafaudages supplémentaires.

1. Coupez les échafaudages en poly(acide lactique) (PLA) en morceaux de la taille d’une cavité de résection (environ 2 mm x 2 mm). Les échafaudages peuvent être coupés à la main à l’aide de ciseaux ou d’une perforatrice pour plus de répétabilité.
2. Stériliser en immergeant dans de l’éthanol à 70 % pendant 15 min suivi d’une immersion dans du PBS. Placez l'échafaudage dans un milieu d'aigle modifié de Dulbecco contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine pendant la préparation des cellules pour l'ensemencement.
3. Soulever les CSM cultivées à l’aide de trypsine à 0,05 % (3 à 5 mL pour une fiole T75). Incuber à 37 °C pendant 5 min. Assurez-vous que les cellules se sont soulevées, puis ajoutez 7 à 10 ml de DMEM dans le ballon pour inactiver la trypsine.
4. Transférer le contenu du ballon dans un tube à centrifuger de 15 ml. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Granulés 5 x 10⁵ MSC pour chaque échafaudage par centrifugation à 100 x g pendant 5 min.
5. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les CSM dans 5 μL de DMEM par 5 x 10⁵ cellules.
6. Préparez les échafaudages pour l’ensemencement en les séchant.
   1. Retirez un échafaudage de l’immersion DMEM à l’aide d’une pince et placez-le temporairement sur le couvercle de la plaque à 6 puits. Soulevez l’échafaudage du couvercle, laissant derrière vous une gouttelette de DMEM en excès.
   2. Remettez l’échafaudage sur le couvercle dans un nouvel endroit sec. Répétez l’opération 3 à 5 fois, puis placez l’échafaudage partiellement séché dans une nouvelle plaque à 6 puits pour l’ensemencement. Répétez l’opération pour chaque échafaudage.
      note: Un échafaudage partiellement séché permet d’obtenir des résultats optimaux d’ensemencement cellulaire. Si l’échafaudage est trop humide, les cellules glisseront de l’échafaudage et adhéreront à la plaque de puits située en dessous. Si l’échafaudage est trop sec, les gouttelettes ne se répandront pas sur l’ensemble de l’échafaudage, ce qui entraînera une mauvaise distribution initiale des cellules.
7. À l’aide d’une pipette, mélangez délicatement le flacon de cellules souches pour homogénéiser la suspension car certaines cellules peuvent s’être déposées au fond.
8. Pipetez lentement une suspension MSC de 2,5 μL fraîchement mélangée directement sur l’échafaudage, en créant une petite gouttelette sur le dessus de l’échafaudage.
9. Ajouter 300 μL de DMEM sur les bords de chaque puits. Cela empêchera l’évaporation rapide des gouttelettes cellulaires. Incuber à 37 °C pendant 30 min, en laissant les cellules se fixer à l’échafaudage.
10. À l’aide d’une pince, retournez doucement les échafaudages dans la plaque du puits. Graine 2,5 μL de suspension MSC fraîchement mélangée (cela donne un total de 5 x 10⁵ cellules ensemencées par échafaudage). Incuber à 37 °C pendant 30 min, en laissant les cellules se fixer à l’échafaudage.
11. Recouvrez les échafaudages de DMEM en ajoutant 2 ml dans chaque puits de la plaque à 6 puits. Soulevez doucement les échafaudages pour permettre aux fluides de s’écouler en dessous. Incuber à 37 °C dans cet état pendant 48 h avant la chirurgie d’implantation.
12. Vérifiez les échafaudages après 24 h et ajoutez/changez de média si une évaporation excessive ou un média décoloré dû à un déséquilibre du pH est observé.