Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Marquage des cellules de glioblastome avec la construction FP635 ou FP720
- Produire et purifier le lentivirus selon le protocole décrit ci-dessous :
- Observez les plats ensemencés le jour 1. Lorsque les cellules sont confluentes à 80-90 %, elles sont prêtes pour la transfection.
REMARQUE : Les cellules doivent encore avoir de la place pour subir 1 à 2 divisions cellulaires
- Préparez le mélange de plasmides en aliquotant les quatre plasmides dans un tube de 50 ml. Pour une préparation en plat de 12 × 15 cm, utilisez 270 μg de vecteur de transfert, 176 μg de pMDL (Gag/Pol), 95 μg de pVSVG (glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculeuse) et 68 μg de pREV.
- Préparez 13,5 mL de 0,25 M de CaCl2 (diluez avec du ddH2O filtré) et ajoutez-les au mélange de plasmides. Ajouter 13,5 mL de solution BBS 2×. Mélangez délicatement en retournant plusieurs fois et incubez 15 min à température ambiante (22–26°).
- Ajouter le mélange de transfection (en l’étalant en gouttes) dans chaque assiette (2,25 mL par assiette). Agitez doucement les plaques et incubez à 3 % de CO2, 37 °C pendant la nuit (16 à 20 h).
- Observez les cellules. Ils devraient atteindre la confluence. Si un marqueur visible (tel que la GFP) est présent dans le plasmide lentivectoriel, l’efficacité de la transfection peut être évaluée visuellement. Idéalement, l’efficacité de transfection devrait être de >90 %.
- Retirer le support, ajouter 15 ml de DMEM frais + 2 % FBS dans chaque plat et transférer à 10 % de CO2, 37 °C. Incuber toute la nuit.
- Recueillir la première récolte de surnageant : Prélever et regrouper le surnageant (12 plats × 15 ml/plat = 180 ml) dans les plats.
- Ajouter 15 ml de DMEM frais + 2 % FBS dans chaque plat. Incuber les plats à 10 % de CO2, 37 °C pendant la nuit. Le récipient contenant le surnageant lentiviral doit être placé dans un confinement secondaire (un sac en plastique scellé fera l’affaire) et stocké à 4 °C.
- Concentrer la préparation virale : Concentrer les particules virales par ultracentrifugation. Centrifuger le surnageant à 70 000 x g pendant 2 h à 20 °C. Il est recommandé d’utiliser des tubes coniques (par opposition aux tubes à fond rond) et des rotors à godets oscillants (par opposition aux rotors à angle fixe) (tout simplement parce que cette combinaison facilite la localisation de la pastille presque invisible). Nous utilisons des tubes coniques avec un rotor Beckman SW28 (capacité de six tubes) à 19 400 tr/min pendant 2 h à 20 °C. Remplissez les tubes avec 30 mL de surnageant. Le volume total de surnageant d’une préparation de plat de 12 × 15 cm est de 360 mL ; Par conséquent, le traitement du volume complet nécessitera deux tours consécutifs. Chargez les tubes, faites le premier essorage, versez le surnageant sans déranger la pastille, rechargez avec du surnageant viral frais et effectuez le deuxième essorage.
- Videz le surnageant et laissez le liquide restant s’écouler en posant les tubes inversés sur du papier absorbant. Siphonnez les gouttelettes restantes à l’aide d’un aspirateur afin d’éliminer tout le liquide de la pastille. La pastille doit être à peine visible sous la forme d’une petite tache translucide.
- Remettre les pastilles virales en suspension dans 100 μL de HBSS 1×. Évitez de mousser. Rincez les tubes avec 100 μL de HBSS 1×. Regroupez les deux volumes pour obtenir un volume final de 200 μL.
- Transférer dans un tube microfuge à bouchon à vis, envelopper dans du parafilm et vortex à basse vitesse pendant 15 à 30 min. La préparation virale remise en suspension aura l’air n’importe où, de claire à légèrement laiteuse.
- Nettoyez la suspension en la faisant tourner pendant 10 s sur une microcentrifugeuse de table. Transférez le surnageant dans un nouveau tube à microfuge à bouchon à vis. Faites des aliquotes de 20 μL de surnageant. Ce surnageant viral est de qualité in vitro.
- Cultiver environ 2,0 x 106 cellules d’une lignée cellulaire de gliome humain avec du DMEM plus 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) dans une boîte de 15 cm ; ou cultiver 2,0 x 106 sphères dérivées de patients atteints de glioblastome humain (GBM-PDX) avec un milieu DMEM/F12 1:1 avec un supplément de B27 plus un facteur de croissance épidermique recombinant humain (EGF ; 20 ng/mL) et un FGF (10 ng/mL) dans une fiole T75.
- Maintenez toutes les cellules à 37 °C, 5 % de CO2 et 100 % d’humidité relative.
- Dissocier les cellules.
- Pour les cellules de gliome : retirer le surnageant des plaques et ajouter 3 à 5 mL de trypsine 1X aux cellules de gliome.
- Pour les sphères GBM : prélever les cellules en les pipetant dans un tube de 15 mL.
- Faites tourner les sphères de GBM à 200 x g pendant 5 min à l’aide d’une centrifugeuse de table à température ambiante.
- Retirer le surnageant et ajouter 3 à 5 ml de solution de décollement cellulaire.
- Incuber toutes les cellules à 37 °C pendant 10 à 15 min.
- Dissociez soigneusement les cellules en pipetant plusieurs fois de haut en bas (assurez-vous que les sphères et les cellules du gliome sont complètement dissociées) et tournez à 200 x g pendant 5 min.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 5 mL de milieu en pipetant plusieurs fois de haut en bas. Déterminer la viabilité cellulaire par exclusion du bleu trypan.
- Plaque 1,0 x 106 de cellules cibles dans une boîte de 10 cm avec 5 mL de milieu par pipetage.
- Transduit des cellules avec des protéines fluorescentes exprimant des protéines fluorescentes à la multiplicité de l’infection (MOI) 5 et incube à 37 °C.
- Après 24 h, retirer le milieu des cellules transduites, ajouter 5 mL de milieu frais et incuber pendant 48 h supplémentaires à 37 °C.
- Dissocier les cellules infectées en une suspension unicellulaire à l’aide de la trypsine comme décrit ci-dessus. Faire tourner les cellules à 200 x g pendant 5 min et les remettre en suspension dans 500 μL de solution de tri (solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 1 % de FBS).
- Pipeter la suspension cellulaire dans les tubes FACS. Co-colorer les cellules avec 1 μL/mL de dichlorhydrate de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour exclure les cellules mortes. Des contrôles négatifs sont nécessaires pour mettre en place les portes du cytomètre en flux (cellules non transduites et cellules non transduites/colorées DAPI).
- Triez les cellules fluorescentes positives/DAPI négatives dans une solution de tri et collectez les cellules triées dans un tube conique de 15 ml.
- Faites tourner les cellules triées à 200 x g pendant 5 min, retirez le surnageant et remettez-le en suspension dans 5 mL de milieu de culture. Ensemencez les cellules triées dans une boîte de 10 cm par pipetage. Incuber à 37 °C pendant au moins 48 à 72 h.
- Élargissez les cellules triées en dissociant les cellules comme décrit ci-dessus et en les plaquant dans plusieurs boîtes pour des expériences in vivo.
