Dosage de la migration des cellules souches tumorales cérébrales (BTSC) pour les études de traitement médicamenteux : une technique d’imagerie in vitro sur cellules vivantes pour analyser l’effet du traitement médicamenteux sur la migration des BTSC

Résumé

Source : Restall, I. et al. Tests d’imagerie de cellules vivantes pour étudier le glioblastome, la tumeur cérébrale, la migration et l’invasion des cellules souches. J. Vis. Exp. (2018)

Dans cette vidéo, nous effectuons un test de migration des cellules souches de tumeurs cérébrales pour analyser l’effet du médicament d’intérêt sur la migration des cellules souches de tumeurs cérébrales vivantes à l’aide d’une plaque de migration de chimiotaxie. L’imagerie des cellules vivantes facilite la visualisation et la quantification de la migration cellulaire pendant le test.

Protocole

1. Essai de migration des cellules souches de tumeurs cérébrales

1. Ensemencer 200 000 cellules dans une fiole T25 dans 8 mL de milieu complet 1 à 2 semaines avant de planifier la réalisation d’un essai de migration.
   note: Le temps entre le placage et la réalisation de l’essai variera en fonction du taux de croissance de la culture de BTSC utilisée.
   1. Pour tester l’effet d’un traitement médicamenteux sur la migration, prétraitez les cellules avec le véhicule approprié, tel que le DMSO, et le médicament d’intérêt en ajoutant les volumes applicables du véhicule ou du stock de médicament directement dans des puits séparés de milieux contenant les cellules.
2. Préparez la plaque de migration de chimiotaxie (Figure 1A) en l’enduisant d’une fine couche de collagène.
   1. Calculez le nombre de puits d’une plaque de chimiotaxie de 96 puits qui devra être recouverte de collagène. Incluez au moins trois puits répétés pour chaque condition.
   2. Diluer 5 mg/mL de collagène de type I à 0,2 mg/mL dans de l’acide acétique pur dilué à 0,14 % dans de l’eau de culture.
   3. Pipeter 0,2 mg/mL de collagène dans les puits d’insertion de la membrane et les puits du réservoir inférieur utilisés.
      note: Les réservoirs inférieurs de la plaque nécessitent 225 μL et les puits d’insertion de la membrane nécessitent 75 μL de collagène pour un revêtement approprié.
   4. Placez la plaque de migration dans un incubateur à 37 °C pendant 1 h. Aspirez la solution de collagène des puits sans rayer le revêtement de collagène.
   5. Lavez les puits 2x avec du PBS stérile. Si la plaque n’est pas utilisée immédiatement, aspirez le PBS et conservez-le à 4 °C jusqu’à 2 semaines. Avant utilisation, réchauffez la plaque de migration de chimiotaxie à température ambiante.
3. Préparez le réservoir inférieur de la plaque de migration de chimiotaxie.
   1. Pipette de 225 μL de milieu (sans facteurs de croissance), complétée par 10 % de FBS comme agent de chimioattraction, vers les puits du réservoir inférieur de la plaque de migration de chimiotaxie.
   2. Placez délicatement l’insert à membrane dans le réservoir inférieur en biais pour éviter de créer des bulles.
4. Plaquez les cellules dans l’insert membranaire de la plaque de migration de chimiotaxie.
   1. Mettre en suspension les BTSC dissociés dans des milieux (sans facteurs de croissance) à une densité cellulaire de 50 000 cellules/mL. Ajouter des médicaments aux médias si vous évaluez la migration au cours de différents traitements médicamenteux. Alternativement, ensemencez un nombre égal de cellules prétraitées et de cellules témoins, tout en maintenant la concentration finale du médicament lors du placage.
   2. Déposer une plaque de 50 μL des CTSB de l’étape 1.4.1 dans chaque puits de la plaque de migration dans les conditions de traitement souhaitées.
5. Imagez la migration de la chimiotaxie.
   1. Placez la plaque de migration de chimiotaxie dans le système d’imagerie de cellules vivantes et réglez le logiciel d’imagerie automatique pour qu’il acquière des images microscopiques de la plaque toutes les 1 à 2 h pendant un maximum de 72 h. À l’aide d’un logiciel commercial (voir la table des matériaux), cliquez avec le bouton droit de la souris sur la chronologie et réglez l’intervalle de balayage à toutes les 2 h pendant 24 h.
      note: L’intervalle de temps et le temps total écoulé varieront entre les cultures BTSC utilisées ; commencer par des intervalles de 2 h pendant 72 h jusqu’à ce que l’expérience ait été acquise avec les cultures individuelles de BTSC. Si un système d’imagerie automatisé n’est pas disponible, les images du même champ de vision peuvent être acquises manuellement à l’aide d’un microscope et d’une caméra connectée au logiciel d’imagerie.
   2. Une fois l’acquisition de l’image terminée, obtenez les images de l’ensemble de l’expérience et créez une définition de traitement à l’aide du logiciel d’analyse qui différencie les cellules de l’arrière-plan de la membrane et des pores de migration (Figure 1B, masque rouge). À l’aide d’un logiciel commercial (voir la table des matériaux), sélectionnez une nouvelle définition de traitement et définissez les paramètres de définition de traitement pour les BTSC sur un seuil de départ de 52, un seuil de croissance de 85, des ajustements de la taille (pixels) de -1 et une zone minimale de 200 μm². Appliquez cette définition de traitement à la face inférieure de la membrane. Modifiez cette analyse si elle ne permet pas de distinguer avec précision les cellules de la membrane d’arrière-plan.
   3. Collectez des données comme la surface cellulaire sur la face inférieure de la membrane pour chacun des trois puits de réplication, ce qui ne compte que les cellules qui ont migré à travers les pores. Graphique de la migration des cellules en μm² (aire des cellules migrées) au cours du temps (Figure 1C).
      note: Assurez-vous que le nombre relatif de cellules plaquées et comptées sur la surface supérieure de la membrane au premier point temporel est similaire (moins de 20 % de variation entre tous les puits) entre toutes les conditions de traitement afin d’éviter tout effet d’un placage inégal. La collecte de données à l’aide du logiciel commercial (voir Table des matériaux) peut être exécutée en lançant la définition de traitement créée à l’étape 1.5.2, en cliquant sur Métriques, puis sur Graphique/exportation, puis sur Exportation de données.

Résultats

Figure 1 : Imagerie de cellules vivantes d’une migration de BTSC. (A) Ceci est un exemple d’une plaque de migration de chimiotaxie à 96 puits recouverte d’une fine couche de collagène de type I avant d’effectuer le test de migration avec des BTSC. Les images montrent i) une plaque avec les trois parties (couvercle, insert à membrane et réservoir) placées ensem...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Matrice matrigel	Corning	Référence 356230
Plaques à 96 puits	Eppendorf	30730119
T25 Nunc EasYFlask	ThermoFisher	156367
Falcon 15 mL tube conique	ThermoFisher	352096
Plaque de chimiotaxie Incucyte ClearView 96 puits	Essen Bioscience	4582
Système d’analyse de cellules vivantes IncuCyte Zoom	Essen Bioscience	Réf. 4545
Logiciel d’analyse de cellules vivantes IncuCyte Zoom	Essen Bioscience	2016A Rev1
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	sigma	D8537
Eau de culture	Lonza BioWhittaker	17-724Q
Sérum fœtal bovin (FBS)	Invitrogen	Référence 12483-020
Collagène de rat I	Trévigen	Référence 3440-100-01
Solution de décollement de cellules Accumax	Technologies cellulaires innovantes	AM105