1. Essai d’invasion de la neurosphère par cellules souches de tumeurs cérébrales
- Ensemencer 200 000 cellules dans 8 mL de milieu complet dans une fiole T25 1 à 2 semaines avant de planifier la réalisation d’un essai d’invasion.
note: Le délai entre le placage et la réalisation de l’essai dépendra du taux de prolifération de la culture BTSC utilisée.
- Pour les cellules prétraitées, ajoutez le composé d’intérêt dans le ballon à la concentration souhaitée pendant le cours temporel prédéterminé avant que les neurosphères ne soient prêtes à être plaquées pour l’invasion.
- Attendez que la taille moyenne de la neurosphère soit d’environ 150 à 200 μm ; en général, cela prend de 7 à 14 jours, selon la culture BTSC utilisée.
note: Il est typique d’observer une distribution des tailles de sphères dans le flacon.
- Inclinez et mélangez délicatement le flacon à l’aide d’une pipette et déplacez 500 μL des neurosphères BTSC dans un tube conique de 1,5 mL pour chaque condition de traitement ; cela sera utilisé pour plaquer trois puits répliqués.
REMARQUE : Les étapes 1.3.1 à 1.3.2 sont facultatives, mais recommandées pour la première expérience d’invasion sur une nouvelle culture de CTB.
- Pour déterminer la densité des neurosphères qui se retrouveront dans le puits, préparez un tube de 1,5 mL comme à l’étape 1.3. Mélangez doucement les neurosphères et déplacez 100 μL dans une plaque séparée de 96 puits et laissez les neurosphères se déposer par gravité pendant 5 min.
- Vérifiez le nombre de neurosphères sous le microscope pour vous assurer que plusieurs neurosphères se trouvent dans la région du puits qui sera imagée sans le surcharger.
note: Les neurosphères envahissantes ont besoin de suffisamment d’espace pour tripler de diamètre sans interagir avec les neurosphères voisines. Le nombre de neurosphères par puits peut être ajusté en comptant le nombre de neurosphères par puits et en ajoutant plus ou moins de neurosphères du ballon T25 au tube conique de 1,5 mL à l’étape 1.3.
- Placez le tube conique de 1,5 mL avec les cellules de l’étape 1.3 sur de la glace et effectuez les étapes 1.5 à 1.7 sur de la glace.
- Laissez les neurosphères se déposer par gravité au fond du tube conique de 1,5 mL pendant 5 minutes et prérefroidissez une plaque étiquetée à 96 puits sur de la glace.
- Remettre en suspension les neurosphères dans la protéine de la matrice extracellulaire.
- Préparez 500 μL d’une solution de collagène de type I à 0,4 mg/mL sur de la glace pour chaque condition de traitement : ajoutez 459 μL de milieu (sans facteurs de croissance), 40 μL de la solution mère de collagène à 5 mg/mL et 0,92 μL de NaOH 1N stérile (tableau 1).
REMARQUE : 500 μL de solution de collagène sont nécessaires par condition de traitement : 100 μL pour chacun des trois puits de réplication et 200 μL d’excès. Des traitements médicamenteux doivent être ajoutés ici à la concentration finale souhaitée, soustraite de la composante média de la solution. Ce protocole décrit l’utilisation du collagène de type I comme protéine de la matrice extracellulaire ; Cependant, toute protéine de la matrice extracellulaire peut être testée. De plus, pour les cultures BTSC qui ont des taux d’invasion plus lents, les facteurs de croissance ou FBS peuvent être complétés dans les milieux pour augmenter le taux d’invasion.
- Une fois que les neurosphères de l’étape 1.5 se sont installées, aspirez autant de milieu que possible sans perdre la pastille de neurosphère qui s’est déposée au fond. Remettez doucement les neurosphères en suspension dans 500 μL de la solution de collagène préparée à l’étape 1.6.1.
- Ajoutez 100 μL du mélange de collagène et de neurosphère dans trois puits répétés de la plaque de 96 puits sur de la glace. Laissez les neurosphères se déposer sur la glace pendant 5 min.
- Transférez la plaque à 96 puits dans un incubateur à 37 °C pendant 5 min pour permettre la polymérisation du collagène.
- Préparez-vous immédiatement à imager la plaque à 96 puits.
- Placez la plaque à 96 puits dans le plateau d’un système d’imagerie de cellules vivantes ou sur la platine d’un microscope pour acquérir une image comme référence pour la taille de la neurosphère au moment du placage, avant le début de l’invasion.
- Acquérez des images toutes les heures jusqu’à ce que le taux d’invasion ait atteint un plateau ; généralement, cela se produit dans les 24 h
note: L’intervalle d’imagerie peut être modifié en fonction de l’équipement utilisé. L’intervalle d’imagerie et le temps total écoulé peuvent également être modifiés pour les cultures BTSC qui ont des taux d’invasion différents.
- Déterminez la surface croissante des BTSC lorsqu’ils envahissent la matrice au fil du temps.
note: La surface des cellules au moment du placage, calculée comme la moyenne de trois puits répliqués, doit être similaire (moins de 20 % de variation entre tous les puits) entre les différentes conditions de traitement pour s’assurer que les différences dans l’invasion des CTBT ne sont pas fortement affectées par le nombre ou la taille des neurosphères plaquées.
- Pour le système d’analyse de cellules vivantes, utilisez un objectif 10X pour l’acquisition d’images et acquérez quatre images par puits pour les trois puits répliqués. Pour déterminer la surface relative de la cellule, représentée par le pourcentage de confluence du puits, configurez une définition de traitement qui met spécifiquement en évidence les cellules sur l’arrière-plan du puits. À l’aide d’un logiciel commercial (voir la table des matériaux), sélectionnez une nouvelle définition de traitement et réglez le réglage de segmentation sur 0,8, la surface minimale sur 300 μm2 et l’excentricité maximale sur 0,99. Modifiez cette analyse si elle ne distingue pas correctement les cellules de l’arrière-plan.
note: Si vous utilisez d’autres méthodes pour imager l’invasion de la neurosphère au fil du temps, il est recommandé d’obtenir plusieurs champs de vision pour les trois puits répliqués au fil du temps. Cependant, le fait de ne pas imager exactement le même champ de vision à chaque intervalle augmentera l’erreur type des données collectées. Un logiciel informatique peut être utilisé pour aider à mesurer la surface des cellules envahissantes dans chaque image.
- Collectez des données sous forme de surface cellulaire totale (relative ou absolue) pour chaque puits à chaque point temporel et déterminez la moyenne des trois puits répliqués. Tracez graphiquement l’invasion des BTSC en traçant l’augmentation de la surface cellulaire au fil du temps.
| Préparation de la solution de collagène |
| Stock [Collagène] (mg/mL) | 5 |
| Finale [Collagène] (mg/mL) | 0,4 |
| Nombre de puits nécessaires : | 5 |
| Volume total (μL) | 500 |
| Volume de collagène stock (μL) | 40 |
| Volume de 1N NaOH (μL) | 0,92 |
| Volume du support (μL) | 459 |
Tableau 1 : Préparation de la solution de collagène de type I à 0,4 mg/mL. On y trouve la liste des concentrations initiales et finales connues de la solution de collagène de type I. Les volumes énumérés sont suffisants pour transformer les neurosphères en trois puits de réplication, plus deux en cas d’excès, et peuvent inclure une seule condition de traitement, comme décrit en détail à l’étape 1 du protocole.
