Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des diapositives à motifs
- Préparation du substrat pour le micropatterning
- Traiter les lamelles en verre circulaires de 18 mm par activation air/plasma pendant 5 min. Placer les lamelles dans une chambre fermée avec 100 μL de triéthoxysilane (3-aminopropyle) dans un dessiccateur pendant 1 h.
- Incuber avec 100 mg/mL de valérate de poly (éthylène glycol)-succinimidyle (poids moléculaire 5 000 (Peg-SVA)) dans un tampon carbonaté de 10 mM, pH > 8, pendant 1 h. Rincer abondamment à l’eau ultrapure et sécher sous une hotte chimique.
note: À ce stade, l’échantillon peut être stocké à 4°C dans l’obscurité pour une utilisation ultérieure.
- Ajouter le photoinitiateur, le chlorure de 4-benzoylbenzoyl-triméthylammonium (PLPP), à 14,7 mg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
note: Une forme concentrée de PLPP, un gel PLPP, peut également être utilisée. Il en résulte un temps d’éclairage ultraviolet (UV) plus court nécessaire pour dégrader la brosse PEG (100 mJ/mm2).
- Photoinitiateur Dépôt de gel
- Préparez un mélange de 3 μL de gel PLPP et de 50 μL d’éthanol absolu à déposer au centre de la lame. Placez l’échantillon sous une hotte chimique jusqu’à l’évaporation complète de l’éthanol absolu.
note: À ce stade, l’échantillon peut être stocké à 4°C dans l’obscurité pour une utilisation ultérieure.
- Micropatterning de lames de verre
- Montez la lamelle dans une chambre Ludin et placez-la sur la platine motorisée d’un microscope équipé d’un système d’auto-focus.
- Chargez dans le logiciel des images correspondant aux micromotifs envisagés. Appliquez ces paramètres : réplication 4 x 4 fois, espacement de 200μm, dose UV de 1 000 mJ/mm2. Après la séquence d’éclairage UV automatique, rincez le PLPP avec plusieurs lavages PBS.
note: Si du gel PLPP a été utilisé, l’enlever par des lavages intensifs à l’eau déminéralisée, le sécher dans un jet de N2 et le conserver à 4 °C.
- Incuber avec de la laminine (50 μg/mL dans du PBS) pendant 30 min. Laver abondamment avec du PBS.
REMARQUE : Une solution fluorescente de protéine fluorescente verte purifiée (GFP, 10 μg/mL dans le PBS) peut être mélangée avec de la laminine pour visualiser les micromotifs par microscopie à fluorescence.
2. Préparation des neurones et des cellules GBM pour la co-culture
- Culture de neurones embryonnaires de l’hippocampe de rat
- Disséquer l'hippocampe de rats embryonnaires (E18) et transférer le tissu dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS)/1 mM d'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinésulfonique (HEPES)/pénicilline-streptomycine dans un tube de 15 mL. Retirez l’excès de solution sans assécher l’hippocampe.
- Ajouter 5 ml d’acide tétraacétique trypsine-éthylènediamine (EDTA) complété par de la pénicilline (10 000 unités/mL)/streptomycine (10 000 μg/mL) et 1 mM d’HEPES, et incuber pendant 15 min à 37 °C. Laver 2 fois avec la solution HBSS/HEPES/pénicilline-streptomycine, et laisser le tissu dans cette solution pendant 2 à 3 min.
- Dissociez le tissu à l’aide de deux pipettes Pasteur polies à la flamme, en pipetant 10 fois de haut en bas avec chaque tissu, en prenant soin de minimiser la formation de mousse. Comptez les cellules et évaluez la viabilité de la suspension cellulaire. Plaquez les neurones sur des lamelles à micromotifs comme indiqué ci-dessous.
note: Le taux de viabilité cellulaire est de 85 à 90 % après l’extraction.
- Culture cellulaire de neurones sur des lamelles à micromotifs
- Réhydratez des lames de verre à micromotifs avec du PBS et incubez un milieu de culture de cellules neuronales complet.
- Ensemencez les neurones de l’hippocampe obtenus à partir de rats E18 Sprague-Dawley directement sur la lamelle en verre à micromotifs à une densité de 50 000 cellules parcm2 dans un milieu neurobasal (NBM) enrichi de 3 % de sérum de cheval. Placez les neurones micropatternés dans l’incubateur (37 °C, 5 % CO2) pendant 48 h.
note: Après ~6 h, on peut voir les neurones primaires de l’hippocampe adhérer aux micromotifs de la laminine.
- Co-culture de cellules souches humaines de type GBM sur des neurones
- Au fur et à mesure que les cellules en forme de sphéroïde se développent en suspension, centrifugez la suspension pendant 5 min à 200 × g. Lavez les sphéroïdes avec 5 ml de PBS et incubez les cellules avec 0,5 ml du réactif de dissociation cellulaire (voir le tableau des matières) pendant 5 min à 37 °C.
- Ajoutez 4,5 ml de NBM complet (complété par un supplément de B27, de l’héparine, du facteur de croissance des fibroblastes 2, de la pénicilline et de la streptomycine, comme décrit précédemment) et comptez les cellules à l’aide d’une technique de comptage automatique.
- Ensemencez 1 000 cellules GBM sur la culture neuronale micropatternée dans le NBM enrichi de 3 % de sérum de cheval. Incuber la plaque à 37 °C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité.
