Isolement et culture de péricytes cérébraux primaires : procédure d’isolement et de culture de péricytes à partir de capillaires cérébraux bovins sans contamination des cellules endothéliales

Dans cet article

Résumé

Source : Hørlyck, S. et al. Culture de péricytes capillaires cérébraux pour les mesures de calcium cytosolique et les études d’imagerie calcique.J. Vis. Exp. (2020)

Dans cette vidéo, nous montrons la procédure d’isolement et de culture des péricytes à partir de capillaires cérébraux bovins sans contamination des cellules endothéliales.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Ensemencement et culture des capillaires bovins

Jour 0 : Mélangez 0,7 ml de collagène IV avec 6,3 ml de PBS. Ajouter la solution dans une fiole T75 et laisser la fiole pendant 2 h à température ambiante (RT) ou toute la nuit à 4 °C.
Retirez la solution de collagène de la fiole et lavez-la trois fois avec du PBS.
Ajouter 7 mL de solution de travail de fibronectine et laisser le ballon pendant 30 min à RT. Ensuite, retirez la solution de fibronectine et ensemencez les capillaires immédiatement après.
Pendant le temps d’attente de 30 minutes, décongeler un flacon de capillaires dans un bain-marie à 37 °C.
Lorsque les capillaires sont décongelés, transférez-les immédiatement dans un tube de centrifugation avec 30 mL de DMEM-comp et centrifugez-les pendant 5 min à 500 x g et RT. Retirez le DMEM-comp du tube et remettez en suspension la pastille capillaire dans 10 mL de DMEM-comp frais.
Transférez la suspension de 10 ml dans la fiole T75 enduite et laissez les capillaires adhérer au fond de la fiole pendant 4 à 6 h dans un incubateur à 37 °C à 10 % de CO₂,
note: Le taux de croissance cellulaire est plus élevé à 10 % de CO₂ plutôt qu’à 5 % de CO₂ conventionnel.
Après 4 à 6 h d’incubation, inspectez le ballon au microscope optique. Des fractions de capillaires doivent maintenant être fixées au fond du ballon (Figure 1, jour 0).
Préparez le GM et aspirez le milieu DMEN-comp très soigneusement dans les capillaires et remplacez-le par 10 ml de GM fraîchement préparé.
Jour 2 : Retirer les OGM des capillaires et les remplacer par 10 ml d’OGM fraîchement préparés. À ce stade, l’excroissance cellulaire des capillaires devrait être visible au microscope optique (figure 1, jours 2 et 3).

2. Isolement des péricytes primaires à partir de capillaires cérébraux bovins

Jour 4 : Inspectez les capillaires au microscope optique.
note: Le ballon doit maintenant être confluent à environ 60 à 70 % pour fournir une quantité appropriée de péricytes (figure 1, jour 4). Si ce n’est pas le cas ; remplacer le GM par 10 ml de milieu frais et laisser le flacon dans l’incubateur pendant une autre journée.
Aspirez le milieu et lavez doucement les cellules dans du PBS.
Ajouter 2 mL de trypsine-EDTA décongelée pour les cellules endothéliales et laisser le flacon dans l’incubateur pendant 1 à 3 min. Sortez fréquemment la fiole et observez au microscope pendant cette période.
note: Les cellules endothéliales doivent se rassembler et se détacher du ballon ; Les péricytes doivent être visibles sous forme de cellules avec une morphologie « fantôme » et être toujours attachés à la surface du flacon. Il s’agit d’une étape délicate et importante.Il est essentiel d’enlever la plupart des cellules endothéliales pour éviter la contamination de la monoculture du péricyte, mais une trypsinisation prolongée peut également détacher les péricytes. Le temps de trypsinisation peut varier légèrement de temps en temps, et il est donc de la plus haute importance d’observer fréquemment le flacon au microscope pendant le traitement.
Tapotez doucement le flacon, lorsque les cellules endothéliales ont commencé à s’arrondir, pour détacher les cellules endothéliales relâchées.
Pour arrêter la trypsinisation, ajoutez 10 mL de DMEM-comp dans la fiole. Rincez soigneusement le ballon plusieurs fois avec le milieu pour éliminer les cellules endothéliales. Aspirer la suspension de cellules endothéliales de la fiole. Les cellules endothéliales peuvent maintenant être utilisées à d’autres fins.
Ajouter 10 ml de DMEM-comp dans la fiole. Regardez au microscope optique pour vous assurer que les péricytes sont toujours présents et attachés au fond. Remettez le flacon dans l’incubateur pour permettre à la culture enrichie en péricytes de se développer.
note: Il est important d’observer la culture pendant les jours qui suivent. S’il y a encore un bon nombre de cellules endothéliales en croissance, un autre traitement à la trypsine peut être effectué.
Laisser la monoculture péricytaire se développer en changeant de milieu DMEM-comp. tous les deux jours. Vérifiez la croissance des cellules au microscope optique (Figure 1, jours 5 à 8).

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Résultats

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Figure 1 : Culture des capillaires et isolement des péricytes.Des capillaires ont été isolés à partir de cervelle bovine fraîche et ensemencés dans des flacons de culture le jour 0. L’excroissance des capillaires cérébraux bovins et l’isolement ultérieur des péricytes ont été suivis pendant des jours au microscope optique. Le jour 4a montre la croissance des cellules endothéliales avant le tra...