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Isolement des capillaires cérébraux du cerveau humain : une méthode optimisée pour extraire les capillaires cérébraux du tissu cérébral humain

8 juillet 2025

Dans cet article

Résumé

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Source : Hartz, A. M. S. et al. Isolement de capillaires cérébraux à partir de tissus cérébraux humains frais. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo présente l’isolement de capillaires cérébraux à partir d’un tissu cérébral humain frais. Les capillaires isolés peuvent ensuite être utilisés pour générer un modèle ex vivo de barrière hémato-encéphalique.

Protocole

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Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.

1. Préparation des échantillons de cerveau

REMARQUE : La figure 1A montre le graphique du flux de travail de l’ensemble de la procédure d’isolement décrite ci-dessous. Le tissu cérébral humain peut provenir de n’importe quelle partie du cortex et peut être utilisé frais ou congelé. Le tissu cérébral congelé peut être décongelé à température ambiante (pas de tampon ; ~30 min pour 10 g). Pour obtenir des résultats comparables, le tissu cérébral doit être obtenu à partir de la même région du cerveau pour chaque expérience. Ce protocole est optimisé pour le cortex cérébral humain frais (intervalle post-mortem ou PMI <4 h) qui n’a pas été congelé.

  1. Préparation du tissu cérébral humain : Documentez le poids du tissu cérébral. Tous les chiffres du protocole suivant sont appropriés pour 10 g de tissu cérébral humain frais. Placez le tissu cérébral dans une boîte de Pétri de 100 mm. Retirez soigneusement toutes les méninges à l’aide d’une pince. Utilisez un scalpel pour couper la substance blanche.
  2. Hachage du tissu cérébral humain : Découpez soigneusement le tissu cérébral et hachez-le avec un scalpel. Émincer environ 5 minutes (morceaux de 2 à 3 mm). Transférez le tissu cérébral dans le broyeur de tissus Potter-Elvehjem. Ajouter 30 ml de tampon d’isolement.
    note: Les morceaux de tissu haché sont difficiles à voir car le tissu cérébral se transforme en bouillie par le processus de hachage.

2. Homogénéisation

  1. Broyeur de mouchoirs Potter-Elvehjem (dégagement : 150-230 μm) : homogénéisez chaque échantillon en 100 coups à une vitesse d’homogénéisation de 50 tr/min. Documentez le temps tous les 25 coups et le temps total nécessaire pour 100 coups. Voir le tableau 1 pour un protocole d’homogénéisation proposé ; Le temps total d’homogénéisation de 10 g du cortex frontal humain est d’environ 22 min. Ne remuez pas l’air pour éviter les bulles.
  2. Homogénéisateur Dounce (dégagement : 80 à 130 μm) : Transférez l’homogénisation dans un homogénéisateur Dounce sur glace. Homogénéiser la suspension avec 20 temps (~6 s/course, total de ~2 min). Évitez les bulles.

3. Centrifugation

  1. Répartissez l’homogénat cérébral également dans quatre tubes de centrifugation de 50 mL et documentez le volume total de l’homogénat. Répartir 50 mL de tampon à gradient de densité dans les tubes de centrifugation (12,5 mL par tube). Utilisez 10 ml de tampon d’isolement pour rincer le pilon et l’homogénéisateur et répartissez-les dans les quatre tubes de centrifugation (~2,5 ml par tube).
  2. Fermez hermétiquement les tubes de centrifugation à l’aide des bouchons. Mélangez l’homogénat, le milieu à gradient de densité et le tampon en secouant vigoureusement les tubes. Centrifugeuse à 5 800 x g pendant 15 min à 4 °C (rotor à angle fixe) ; Sélectionnez une vitesse de décélération moyenne pour maintenir la pastille attachée au tube. Jeter le surnageant et remettre en suspension chaque pastille dans 2 mL de BSA à 1 %.

4. Filtration

REMARQUE : Pour séparer les capillaires des globules rouges et autres débris cellulaires, plusieurs étapes de filtration sont nécessaires.

  1. Maille de 300 μm : Après avoir remis la pastille en suspension, filtrez la suspension à travers la maille de 300 μm. Les capillaires sont filtrés à travers le maillage, tandis que les vaisseaux plus gros et les débris cérébraux plus gros restent sur le treillis. Lavez soigneusement le treillis avec jusqu’à 50 ml de BSA à 1 %. Jetez le mesh.
    note: Cette étape de filtration nettoie la suspension capillaire de tout vaisseau plus gros ou de morceaux de débris cérébraux.
  2. Filtre de déformation cellulaire 30 μM
    note: Cette étape de filtration sépare les capillaires des globules rouges et autres débris cérébraux.
    1. Répartissez le filtrat capillaire de l’étape 4.1 sur les cinq filtres de déformation cellulaire de 30 μm (environ 10 mL de filtrat capillaire par filtre de déformation cellulaire). Les capillaires sont retenus par ce filtre, tandis que les globules rouges, les autres cellules uniques et les petits débris cérébraux passent à travers le filtre et sont collectés dans le filtrat.
    2. Lavez chaque filtre avec 25 ml de BSA à 1 %. Ensuite, versez tous les filtrats sur le sixième filtre pour augmenter le rendement. Lavez chaque filtre avec 50 ml de BSA à 1 %; Conservez les filtres de déformation cellulaire contenant les capillaires et jetez le filtrat.

5. Collecte capillaire

  1. Retournez les filtres et lavez les capillaires avec 50 ml de BSA à 1 % pour chaque filtre dans des tubes de 50 ml. Appliquez doucement une pression avec la pointe de la pipette d’une pipette de 5 ml et déplacez-la sur le filtre pour éliminer les capillaires cérébraux.
  2. Assurez-vous de laver tous les capillaires cérébraux, en particulier du bord du filtre. Évitez les bulles, car cela rend le processus de filtration plus difficile et augmente le risque de perte capillaire.

6. Lavage

  1. Après avoir collecté les capillaires, centrifuger tous les échantillons à 1 500 x g pendant 3 min à 4 °C (rotor à godets oscillants). Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans environ 3 mL de tampon d’isolement. Combinez toutes les pastilles remises en suspension d’un échantillon dans un tube conique de 15 mL et remplissez-le d’un tampon d’isolement. Centrifuger à nouveau à 1 500 x g pendant 3 min à 4 °C et laver deux fois de plus.
  2. Documentez la pureté capillaire à l’aide d’un microscope (grossissement de 100X) et d’une caméra (Figure 1B).
    note: Le rendement capillaire cérébral de 10 g de tissu cérébral humain est généralement d’environ 100 mg. Les capillaires cérébraux isolés peuvent maintenant être utilisés pour des expériences, traités (par exemple, lysat, isolation membranaire), ou être congelés et stockés à -80 °C dans des cryotubes pendant au moins 6 à 12 mois (éviter plusieurs cycles de congélation-décongélation).
CoupsHeure
1 à 257 à 7,5
26 à 505 à 5,5
51 à 755 à 5,5
76 à 1005 à 5,5
Temps total :De 22 à 24 minutes

Tableau 1 : Protocole d’homogénéisation. Le protocole d’homogénéisation du broyeur de tissus Potter-Elvehjem pour homogénéiser 10 g de cortex frontal humain à une vitesse d’homogénéisation de 50 tr/min. Notez que les premiers passages nécessitent un temps supplémentaire pour homogénéiser le tissu haché. Après cette homogénéisation initiale, chaque course dure 12 s (6 s pour le mouvement vers le bas, 6 s pour le mouvement vers le haut). Ainsi, après l’homogénéisation initiale, 5 coups peuvent être accomplis en 1 min, ou 25 coups en 5 min.

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Résultats

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figure-results-1
Figure 1 : Organigramme pour l’isolation capillaire. (A) Le pictogramme illustre les principales étapes de la procédure d’isolement des capillaires cérébraux à partir de tissus humains frais. (B) L’image montre des capillaires cérébraux humains isolés sous un microscope optique directement après l’isolement (grossissement de 100X).

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Équipement de protection individuelle (EPI)
Gants en latex Diamond Grip Plus, Microflex MediumVWR, Radnor, Pennsylvanie, États-UnisRéférence 32916-636epi
Blouses de protection jetablesVWR, Radnor, Pennsylvanie, États-UnisRéférence 470146-214EPI ; en raison de la nature du matériel de source humaine, l’utilisation d’une blouse de laboratoire jetable est recommandée
Écran facial, jetableThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis19460102EPI ; en raison de la nature du matériel de source humaine, l’utilisation d’un écran facial jetable est recommandée
Matériaux de sécurité
Clavies Sacs autoclave haute température 8 x 12Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-UnisRéférence 01-815-6
Papier d’établi sec Versi 18 » x 20 »Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-UnisRéférence 14-206-32Pour couvrir les zones de travail
Systèmes de conteneurs VWR SharpsThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-UnisRéférence 75800-272Pour les scalpels usagés
Eau de Javel 8,2 % Clorox germicide 64 oz.Centre d’approvisionnement du Royaume-Uni, Lexington, KY, États-Unis323775
Equipement
Réfrigérateur 4 °CThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-UnisTél. : 13-986-148
PH-mètre Accume BASIC AB15Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-UnisAB15
Heidolph RZR 2102 ContrôleHeidolph, Elk Grove Village, IL, États-UnisRéférence : 501-21024-01-3
Centrifugeuse Sorvall LEGEND XTRThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis75004521
Microscope de dissection Leica L2Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, États-UnisUtilisé pour enlever les méninges
Homogénéisateur POLYTRON PT2500Kinematica AG, Lucerne, Suisse9158168
Echelle P-403Denver Instrument, Bohemia, NY, États-Unis191392
Mini Stir standardThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis1151050
Thermo-flacons à l’azote liquide DewarThermal Scientific, Mansfiled, TX, États-UnisRéférence 11-670-4CUtilisé pour congeler le tissu
Balance analytique Voyager ProOHAUS, Parsippany, NJ, États-UnisVP214CN
Microcope ZEISS AxiovertCarl Zeiss, Inc Thornwood, NY, États-UnisUtilisé pour vérifier les capillaires isolés
Outils et verrerie
Finnpipette II Pipette 1-5 mLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-UnisRéférence 21377823T1Laver les capillaires du filtre
Finnpipette II Pipette 100-1 000 μLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-UnisRéférence 21377821T1Remise en suspension des granulés dans BSA
Pipet BoyIntegra, Hudson, NH, États-Unis739658
50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/csVWR, Radnor, Pennsylvanie, États-UnisRéférence 21008-951
Lames de scalpel EISCOThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-UnisS95938CPour hacher le tissu cérébral
PARAFILMVWR, Radnor, Pennsylvanie, États-UnisRéférence 52858-000Pour couvrir le bécher et la fiole jaugée
Thermo Scientific Finntip Pointes de pipette 5 mLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-UnisTél. : 21-377-304Pour laver les capillaires du filtre
Seringue de 60 mL avec Luer-LokThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-UnisBD309653Utilisé avec une bague de connecteur pour filtrer les capillaires
Manche de scalpel #4Fine Science Tools, Foster City, Californie, États-UnisRéférence 10060-13Utilisé pour le hachage
Pince Dumont #5Fine Science Tools, Foster City, Californie, États-UnisRéférence 11251-10Utilisé pour enlever les méninges
Potter-Elvehjem Broyeur de mouchoirsThomas Scientific, Swedesboro, NJ, États-Unis3,43E + 28Volume de 50 mL, dégagement : 150-230 μm
Homogénéisateur DounceVWR, Radnor PA États-UnisRéférence 62400-642Volume de 15 mL, dégagement : 80-130 μm
Filtres tissés Spectra/Mesh (300 μm)Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, États-Unis146424Utilisé pour filtrer la suspension capillaire afin d’éliminer les méninges qui peuvent rester
pluriStrainers (taille des pores : 30 μm)pluriSelect Life Science, Leipzig, AllemagneRéférence 43-50030-03
Bague de connecteurpluriSelect Life Science, Leipzig, AllemagneRéférence 41-50000-03Réutilisation plusieurs fois
Fiole jaugée de 1 LPour la préparation du tampon d’isolement
1 L de bécherPour la préparation de 1 % BSA
Barre d’agitationPour la préparation de 1 % BSA et Ficoll®
Bouteille Schott (60 ml)Pour la préparation de Ficoll®
Seau à glacePour garder tout froid
Boîte de Pétri de 100 mmPour le hachage du tissu cérébral
Grattoir de cellules de culture tissulaireVWR, Radnor, Pennsylvanie, États-UnisRéférence 89260-222Pour éliminer le surnageant après centrifugation
Produits chimiques
BSA Fraction V, A-9647Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-UnisA9647-500gPréparer en DPBS avec du Ca2+ et du Mg2+ la veille. Évitez les bulles pendant la préparation. Conserver au réfrigérateur. Remuez lentement pendant 10 min avant utilisation.
DPBS avec Ca2+ et Mg2+HycloneSH30264.FSDPBS - partie de la mémoire tampon d’isolement
Ficoll PM400Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-UnisRéf. F4375Une mesure exacte est importante ici. Peser en bouteille avec agitateur. Agitez vigoureusement après avoir ajouté DPBS. Conserver au réfrigérateur O/N. Le temps sera dégagé dans la matinée. Remuez doucement pendant 10-15 min avant utilisation. Garder sur la glace jusqu’à utilisation.
Glucose (D-(+) Dextrose)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-UnisG7528Concentration de glucose (D-(+) Dextrose) : 5 mM
Solution étalon d’hydroxyde de sodiumSigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-UnisRéférence 71474Pour ajuster le pH du DPBS
Pyruvate de sodiumSigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-UnisRéf. P2256Concentration : 1 mM

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Mots-clés

Cerebral CapillariesHuman Brain TissueDensity Gradient CentrifugationFiltration MethodBSA Supplemented BufferCapillary Isolation ProtocolBlood Brain Barrier ModelTissue HomogenizationMicroscopic AnalysisCapillary Purity Assessment

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