Zymographie peptidique fluorescente : une technique modifiée pour détecter l’activité de la protéase à l’aide de substrats fluorogènes dans des gels de zymogramme

Résumé

Source : Deshmukh, A. A. et al. Détection de l’activité de la protéase par zymographie peptidique fluorescente. J. Vis. Exp. (2019)

Dans cette vidéo, nous effectuons une zymographie, une technique électrophorétique, pour analyser l’activité protéolytique dans des échantillons biologiques.

Protocole

1. Électrophorèse d’échantillons biologiques dans des gels de zymographie peptidique

1. Dissoudre les échantillons dans un tampon d’échantillon de zymographie conventionnel (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25 % glycérol, 4 % SDS, 0,01 % bleu de bromophénol). Pour les échantillons de cellules et de tissus, ~30 μg de protéines totales par puits sont recommandés, et 50 à 100 ng de protéines pour les étalons MMP.
2. Ajouter 400 ml de 1x Tris-Glycine SDS Running Buffer dans l’appareil de gel. Chargez jusqu’à 35 μL d’échantillon par puits. Faites fonctionner les échantillons à 120 V à 4 °C pendant 1,5 heure ou jusqu’à ce que les normes de poids moléculaire indiquent que les protéases d’intérêt se trouvent à l’intérieur de la couche de gel de résolution peptidique (qui a une couleur orange visible).
   note: La plupart des MMP et leurs variantes se situent dans la plage de 35 à 100 kDa. Lorsque les normes de poids moléculaire indiquent que ces poids se trouvent à l’intérieur de la couche de gel de résolution peptidique, l’électrophorèse peut être arrêtée. Le même principe peut être appliqué à d’autres classes de protéases dont le poids moléculaire est connu. S’il y a un intérêt à détecter plusieurs protéases sur une plus grande gamme de poids moléculaires, réduisez la taille de la couche de gel de résolution et augmentez la taille de la couche de gel de résolution peptidique.
3. Après l’électrophorèse, retirer les gels de la cassette en plastique et laver les gels trois fois pendant 10 minutes chacune à température ambiante sous une légère agitation dans un tampon de renaturation contenant 2,5 % de Triton X-100, 1 μM de ZnCl₂ et 5 mM de CaCl₂ dans 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5.
4. Transférez les gels dans une solution tampon en développement contenant 1 % de Triton X-100, 1 μM ZnCl₂ et 5 mM de CaCl₂ dans 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5 pendant 15 min. Remplacer par une solution tampon en développement fraîche et incuber les gels à 37 °C sous une légère agitation pendant 24 heures, en s’assurant que les gels sont complètement immergés dans la solution.
5. Après 24 heures, l’image se glace à l’aide d’un scanner/imageur à gel fluorescent utilisant les filtres d’excitation et d’émission appropriés.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cassettes de gel vides de 1,5 mm	ThermoFisher Scientific	NC2015
20 % SDS Solution	Ambion	AM9820
3x tampon d’échantillon de zymographie	Bio-Rad	1610764
Kit Azido-PEG3-Maléimide	Cliquez sur Outils de chimie	AZ107
Bloc d’alimentation de base PowerPac	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard	Bio-Rad	Référence 161-0374
Aiguilles hypodermiques PrecisionGlide	Fisher Scientific	Référence 14-826