Ouverture de la barrière hémato-encéphalique médiée par des microbulles à base d’ultrasons Focus : une technique pour créer des ouvertures transitoires localisées dans la barrière hémato-encéphalique de souris par sonoporation

Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.

1. Système d’échographie focalisée

REMARQUE : La configuration décrite est un système de perturbation BBB construit en interne basé sur des composants disponibles dans le commerce et comprend un cône personnalisé imprimé en 3D et une plate-forme stéréotaxique détachable. Le système est conçu modulaire, ce qui facilite les modifications en fonction des équipements disponibles et de l’utilisation spécifique. Le protocole décrit la procédure de sonoporation d’une zone plus grande dans la région pontique du cerveau de la souris. En ajustant l’emplacement cible, différentes parties du cerveau pourraient être ciblées. Dans cette étude, une sonde mono-élément de 1 MHz avec une distance focale de 75 mm, une ouverture de 60 mm et une zone focale de 1,5 x 1,5 x 5 mm (FWHM de pression de crête) a été utilisée. Le plan focal du transducteur est positionné à travers le crâne de l’animal dans le plan horizontal qui croise les barres d’oreille.

1. Sélectionnez une sonde appropriée pour l’ouverture de la BHE chez les rongeurs.
   note: En fonction des propriétés des microbulles et de la fréquence utilisée, les paramètres acoustiques, en particulier l’indice mécanique (IM), sont susceptibles d’être modifiés.
2. Placez le transducteur dans le cône imprimé en 3D.
3. Utilisez une membrane mylar acoustiquement transparente à l’extrémité inférieure du cône pour réaliser le couplage acoustique du trajet de propagation du faisceau, et remplissez le cône avec de l’eau dégazée.
4. Montez le transducteur au-dessus de l’animal sur une platine linéaire motorisée, comme le montre la figure 1, permettant un positionnement vertical automatique du transducteur.
5. Concevoir une plate-forme stéréotaxique détachable basée sur les exigences de l’étude, qui comprend un chauffage régulé en température, des barres d’occlusion et d’oreille, une anesthésie et des marqueurs fipères multimodaux, comme le montrent les figures 1 et 2. Le montage de la plate-forme stéréotaxique consiste en un système de platine linéaire 2D, qui permet un positionnement automatique précis (< 0,1 mm) de l’animal sous le faisceau.
6. Connectez le transducteur à la chaîne d’émission acoustique illustrée à la figure 1 , composée d’un transducteur, d’un générateur de fonctions et d’un amplificateur de puissance.
7. Concevoir un pipeline de traitement d’images pour détecter les marqueurs repères multi-modaux qui permettent un ciblage précis de la sonoporation de la zone cérébrale d’intérêt et la collecte des données de cavitation détectées par l’hydrophone à aiguille.
8. Calibrez le système et déterminez le point focal du transducteur en fonction du positionnement vertical de l’animal sur la plate-forme stéréotaxique.

2. Préparation des animaux

REMARQUE : Le protocole suivant est spécifié pour les souris mais peut être adapté pour les rats. Pour ces expériences, des souris Foxn1-/- femelles athymiques nues (âgées de 6 à 8 semaines) ont été utilisées.

1. Laissez l’animal s’acclimater pendant au moins une semaine dans l’animalerie et pesez-le régulièrement.
2. Administrer la buprénorphine (0,05 mg/kg) par injection sous-cutanée (s.c.) 30 min avant le traitement FUS pour commencer le traitement analgésique.
3. Anesthésier l’animal avec 3 % d’isoflurane, 2 L/min O₂ et vérifier que l’animal est profondément anesthésié. Gardez les animaux anesthésiés pendant toute la procédure et surveillez la fréquence respiratoire et la fréquence cardiaque pour ajuster la concentration d’isoflurane au besoin.
4. Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir la sécheresse oculaire et éviter d’éventuelles blessures.
5. Retirez les poils sur le dessus de la tête à l’aide d’un rasoir et d’une crème dépilatoire et lavez-les ensuite à l’eau pour éliminer tout résidu et éviter toute irritation de la peau.
6. Pour les expériences avec des modèles tumoraux BLI, injectez 150 μL de D-luciférine (30 mg/mL) par voie intrapéritonéale (i.p.) avec une seringue à insuline 29G pour le guidage par image BLI.
7. Insérez un cathéter de veine caudale de 26 à 30 g et rincez le cathéter et la veine avec un petit volume de solution d’héparine (5 UI/mL). Remplissez le cathéter avec une solution d’héparine pour éviter la coagulation du sang.
   note: Un bon cathétérisme est observé lorsqu’il y a un reflux sanguin dans le cathéter. Évitez les bulles d’air dans le cathéter pour éviter les embolies. Pour éviter une pression d’injection excessive, assurez-vous que la longueur du cathéter est aussi courte que possible.
8. Placez l’animal sur la plate-forme stéréotaxique à température régulée pour éviter l’hypothermie.
   note: L’hypothermie réduit la circulation sanguine, ce qui peut affecter l’injection/circulation des microbulles et la pharmacocinétique des médicaments.
9. Immobiliser et fixer la tête de l’animal sur la plate-forme stéréotaxique à l’aide de barres d’oreille et d’une barre de morsure. Fixez le corps avec une sangle et collez la queue de l’animal à la plate-forme.

3. Ultrasons focalisés guidés par l’image in vivo

REMARQUE : Pour ce protocole, on a utilisé un transducteur monoélément de 1 MHz avec une impulsion en rafale de tonalité d’une durée de 10 ms, un MI de 0,4 et une fréquence de répétition d’impulsion de 1,6 Hz avec 40 cycles pendant 240 s. Le protocole est optimisé pour les microbulles stabilisées par des phospholipides contenant de l’hexafluorure de soufre (SF₆) en tant que gaz inoffensif, le diamètre moyen des bulles étant de 2,5 μm et plus de 90 % des bulles étant inférieures à 8 μm.

1. Placez la plate-forme stéréotaxique avec l’animal monté dans la modalité d’imagerie (par exemple, BLI ou rayons X) et prenez des images de l’animal.
2. Utilisez les marqueurs de repère multimodal en combinaison avec le pipeline de traitement d’image pour marquer la position de l’animal en fonction du point focal du transducteur.
3. Déterminez la zone cible en plaçant un contour cérébral sur l’image radiographique acquise ou en utilisant des images BLI pour déterminer le centre de la tumeur (Figure 2). La position de parties spécifiques du cerveau est spécifiée dans l’Atlas cérébral de Paxinos en utilisant les marques crâniennes bregma et lambda comme points de référence. Par exemple, le pont est situé x=-1.0, y=-0.8 et z=-4.5 de lambda.
4. Protégez les narines et la bouche de l’animal avec du ruban adhésif pour éviter que le gel à ultrasons n’interfère avec la respiration.
5. Appliquez du gel à ultrasons sur le dessus de la tête de l’animal.
6. Rétractez la peau du cou de l’animal, lubrifiez l’hydrophone à aiguille avec du gel à ultrasons et placez l’hydrophone à aiguille à proximité directe de l’os occipital.
7. Guidez la sonde dans la bonne position à l’aide du pipeline de traitement d’image et du point de mise au point.
8. Appliquez les paramètres préconfigurés à tous les appareils connectés et ciblez la région cérébrale qui vous intéresse.
   note: Selon la question de recherche, la tumeur ou les régions du cerveau peuvent être sonopérées sous la forme d’un seul point focal ou d’une forme volumétrique, comme le montre la figure 2.
9. Activez les microbulles comme décrit par le fabricant. Injecter un bolus de 120 μL (5,4 μg) de microbulles.
10. Rincez le cathéter de la veine caudale avec une solution saline pour vérifier l’ouverture du cathéter.
11. Injectez les microbulles et lancez l’insonation.
12. Enregistrez la cavitation des microbulles avec l’hydrophone à aiguille.
13. Administrer un produit de contraste intravasculaire ou un médicament après l’échographie. La dose, le moment et la planification dépendent de l’objectif de l’étude et du médicament.
    note: Le bleu d’Evans est un agent de couleur courant pour évaluer l’ouverture de la BHE.
14. Surveiller l’animal jusqu’au moment prédéterminé ou avant le point final sans cruauté.

Figure 1 : Configuration des ultrasons focalisés. (A) Représentation schématique de la configuration des ultrasons focalisés. (B) Image de la configuration des ultrasons focalisés. Le système se compose d’un transducteur monté de haut en bas sur une platine linéaire 1D sur un deuxième platine 2D pour un positionnement 3D automatique. Le transducteur est construit dans un cône de faisceau rempli d’eau, fermé au fond par une membrane mylar acoustiquement transparente, qui conduit le son vers le crâne de l’animal. Le transducteur est connecté à un amplificateur de puissance, qui est à son tour connecté à un générateur de formes d’onde arbitraires (AWG) pour la génération de signaux. Pour la détection de cavitation, un hydrophone amovible associé à un amplificateur de tension à faible bruit est utilisé. L’hydrophone est placé à proximité directe de l’os occipital. L’hydrophone externe a une surface active de 2 mm et est couplé acoustiquement à du gel à ultrasons. Le signal haute tension de l’impulsion d’excitation ainsi que le signal de cavitation enregistré sont numérisés par un oscilloscope standard de 200 MHz et relayés à un ordinateur de contrôle (non illustré) pour un traitement à la volée et un contrôle en temps réel.

Figure 2 : Flux de travail des ultrasons focalisés. Le flux de travail proposé pour le système d’échographie focalisée commence par (A) le positionnement initial de l’animal sur une plate-forme stéréotaxique détachable, notez l’application du gel de couplage acoustique (appliqué après BLI/X-ray). Simultanément, une imagerie multimodale peut être réalisée pour le ciblage. (B) Dans un premier temps, l’imagerie par rayons X est une possibilité, tandis qu’une région d’intérêt peut être ciblée à l’aide d’un contour du cerveau (qui à son tour est référencé à l’atlas du cerveau de la souris40, adapté à la taille et à la posture du crâne). (C) Alternativement, une image BLI d’une tumeur de gliome diffus de la ligne médiane transfectée par luciférase superposée à une projection d’intensité maximale de rayons X peut être appliquée pour le ciblage. (D) Par la suite, la plate-forme stéréotaxique est montée avec l’animal en position de thérapie avec l’hydrophone et le transducteur attachés. Le transducteur se met automatiquement en position de thérapie et sonique la trajectoire choisie après l’injection du bolus. Le système est optimisé pour les expériences à haut débit, où plusieurs plates-formes permettent un travail entrelacé, comme illustré en haut.