Livraison de gènes basée sur l’électroporation in utero : une technique pour injecter de l’ADN plasmidique dans des cellules cérébelleuses embryonnaires d’embryons murins

Résumé

Source : Feng W. et al. Analyse de perte de fonction médiée par CRISPR dans les cellules granulaires cérébelleuses à l’aide du transfert de gènes basé sur l’électroporation in utero. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo démontre l’administration de l’ADN plasmidique dans les cellules neuronales cérébelleuses d’embryons murins en utilisant l’électroporation in utero. Cette méthode est utile pour comprendre la fonction in vivo des gènes dans le développement normal du cerveau et les changements dans l’expression des gènes des cellules neuronales au cours de la progression tumorale.

Protocole

1. Effectuer l’électroporation in utero

1. Élevez des souris âgées de 6 à 8 semaines et préparez les outils pour l’électroporation in utero. Croisez des souris homozygotes mâles Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP avec des souris femelles CD-1. Chronométrer la gestation des souris CD-1 à partir du jour où le plug vaginal est détecté (E0.5). Les embryons sont électroporés au jour E13.5.
   1. Tirez des capillaires en verre borosilicate (diamètre intérieur : 0,6 à 0,8 mm) à l’aide d’un extracteur de micropipette. Utilisez les paramètres suivants : P = 500, Chaleur = 560, Traction = 150, Vel = 75, Temps = 250. Étiquetez l’embout capillaire avec de l’encre noire pour une meilleure visualisation pendant l’injection. Coupez le cône capillaire au stéréomicroscope à l’aide d’une règle et d’une pince à épiler à aiguille pointue et coupez la pointe à une longueur d’environ 6 mm.
   2. Maintenir l’unité des capillaires pour que l’expérience reste reproductible. Créez un bord biseauté unilatéral pendant le rognage. L’embout doit être aussi tranchant que possible pour faciliter la pénétration de la paroi utérine et éviter d’endommager les tissus de l’embryon.
      note: Vous pouvez également utiliser un micro-broyeur pour régler un angle de 35°. Les capillaires peuvent être conservés à température ambiante dans une boîte de Pétri de 10 cm dans des conditions exemptes d’agents pathogènes.
   3. Autoclave les instruments chirurgicaux.
   4. Mélanger les plasmides d’ARNsg à parts égales avec pT2K-IRES-Luc jusqu’à une concentration finale d’au moins 1 μg/μL pour chaque plasmide et colorer la solution plasmidique en vert rapide (concentration finale de 0,05 %). Préparez une solution mère verte rapide à 1 % avec de l’eau distillée sans endotoxines et filtrez à travers un filtre de 0,22 μm pour éliminer les particules de colorant de la solution.
      note: La co-transfection de pT2K IRES-Luc est facultative, mais permet d’identifier des animaux électroporés viables après la naissance à l’aide de l’imagerie par bioluminescence. Préparez une quantité suffisante de mélange de plasmides pour le nombre total de souris enceintes à opérer. Utilisez environ 15 à 20 μL de mélange par souris (~12 embryons). Procédez immédiatement à la chirurgie.
2. Préparer les souris à la chirurgie
   1. Anesthésie les souris CD-1 enceintes avec de l’isoflurane. Induire l’anesthésie dans une boîte avec 3 à 4 % d’isoflurane en volume (débit d’oxygène : 1,5 L/min) et la maintenir avec 2 % en volume pendant l’opération via le cône nasal.
      note: L’opération complète ne devrait pas prendre plus de 30 minutes. Réduire le nombre d’embryons injectés et électroporés, si nécessaire. Utiliser des gants stériles pour la chirurgie.
   2. Placez la souris sur le dos sur un coussin chauffant et ajustez l’anesthésie.
   3. Injecter un analgésique (métamizol, 800 mg/kg de poids corporel, par voie sous-cutanée (s.c.), 24 h dépôt).
      note: Vous pouvez utiliser d’autres analgésiques autorisés que le Metamizol.
   4. Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir la sécheresse oculaire pendant la chirurgie.
   5. Fixez les membres avec du ruban adhésif et stérilisez l’abdomen avec un désinfectant. Couvrez la souris avec de la gaze, en ne laissant que la zone chirurgicale exposée. Étalez 70 % d’éthanol sur la zone chirurgicale et gazez.
   6. Faites une incision cutanée d’environ 2 cm de long et élargissez doucement l’espace avec des ciseaux chirurgicaux droits. Localisez la linea alba et faites une deuxième incision légèrement plus petite à travers le péritoine à l’aide de ciseaux à tissus à pointe émoussée.
   7. Humidifiez la cavité abdominale ouverte avec du stérile préchauffé 1x PBS.
   8. Extrayez soigneusement les cornes utérines de la cavité abdominale à l’aide d’une pince à anneau. Tirez doucement en saisissant la paroi utérine uniquement au niveau de l’espace entre les sacs vitellins de deux embryons voisins. Évitez toute pression sur l’embryon tout en le tirant à travers l’incision. Élargissez l’incision si nécessaire et prenez des précautions supplémentaires pour positionner les cornes utérines sur l’abdomen sans comprimer le flux sanguin dans l’artère utérine.
      note: Dans certains cas, il est conseillé d’extraire une corne utérine à la fois et de la remplacer avant de procéder avec la deuxième corne utérine.
3. Injection et électroporation d’ADN plasmidique
   1. Aspirez environ 15 μL de solution plasmidique colorée avec le capillaire de verre préparé. Évitez toute bulle d’air pendant ce processus.
      note: La solution plasmidique peut facilement obstruer l’extrémité si sa concentration est élevée. Testez le capillaire en libérant de l’ADN juste avant l’injection.
   2. Tenez doucement l’embryon à l’aide d’une pince annulaire et localisez la zone du cou.
      note: Si l’embryon est dans une position difficile à injecter, sautez-le et optez pour l’embryon suivant. Un repositionnement accru de l’embryon peut augmenter les risques de dommages.
   3. Percez lentement avec l’extrémité du capillaire de verre préalablement préparé dans le quatrième ventricule en pénétrant par le cerveau postérieur dorsal, puis injectez environ 1 μL du mélange plasmidique. Vérifiez que l’ADN teint n’a pas fui du cerveau et qu’il est visible sous la forme d’une structure en forme de losange.
      note: En option, utilisez des loupes 2,5 fois pour une meilleure visualisation du quatrième ventricule et des vaisseaux sanguins environnants. Délivrer des impulsions électriques immédiatement après l’injection pour empêcher la diffusion de la solution plasmidique vers les autres ventricules.
   4. Appliquez des impulsions électriques carrées (5 impulsions, 32 mV, 50 ms sous tension, 950 ms contre l’arrêt) à l’aide d’une pince à épiler en platine (voir le tableau des matériaux). Placez les électrodes latéralement avec le pôle négatif recouvrant l’oreille et le pôle positif positionné au niveau du primordium cérébelleux sur la paroi utérine. Utilisez des plaques d’électrodes de 5 mm de diamètre pour une électroporation efficace des embryons E13.5.
      note: Augmenter le taux de survie des petits en manipulant^{moins de 2}/3 du nombre total d’embryons par mère. Évitez les embryons trop près du col de l’utérus. S’ils sont manipulés, ils peuvent causer des complications pendant le travail et mettre en péril toute la portée. Si les électrodes sont trop proches du cœur de l'embryon, cela peut provoquer un arrêt cardiaque.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bande d’autoclave	Kisker Biotech	150262
Porator électro carré	BTX	ECM830
Kit Maxi Endofree	Qiagen	Référence 12362
éthanol	Merck	107017
Pommade oculaire (Bepanthen)	Bayer	81552983
Vert rapide	Merck	104022
Filtre (0,22 μm)	Merck	F8148
Pince droite	Outils scientifiques fins	Référence 91150-20
Gaze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm)	Fisher Scientific	15387311
Capillaire en verre avec filament	Narishige	GD1-2
Coussin chauffant	ThermoLux	463265 / -67
L’isoflurane	Zoetis	TU061219
Pince à anneau	Outils scientifiques fins	Référence 11103-09
Stéréomicroscope	Nikon	C-PS
Ciseaux chirurgicaux	Outils scientifiques fins	Référence 91460-11
Ciseaux chirurgicaux à pointe émoussée	Outils scientifiques fins	Référence 14072-10
Pince à épiler avec électrodes à disque de 5 mm Platine	Xceltis GmbH	CUY650P5
Métamizol	Wdt
Fil de suture en soie non stérile (0,12 mm)	Outils scientifiques fins	Référence 18020-50
PBS (1x)	Technologies de la vie	14190169
Ciseaux à tissus Blunt (11,5 cm)	Outils scientifiques fins	Référence 14072-10
pCAG-EGxxFP	Addgene	Référence 50716
Plasmide pX330	Addgene	Réf. 42230