Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des souris et chirurgie
REMARQUE : Des souris C57BL/6J mâles et femelles de 8 semaines sont utilisées dans cette étude. Les conditions chirurgicales suivent les règles de l’IACUC de notre établissement. Les instruments sont stérilisés, la surface de travail chirurgicale est désinfectée, l’animal est désinfecté et le chirurgien porte des gants stériles.
- La veille de l’opération, anesthésie la souris à l’aide d’isoflurane à 2 %, puis enlève la fourrure sur toute la longueur du fémur sur la face dorsale avec un rasoir fin ou un agent d’épilation chimique.
- Le jour de l’opération, anesthésez les souris à l’aide d’isofluorane à 2 % dans une chambre d’induction. Confirmez l’anesthésie par un stimulus de pincement de l’orteil et une absence de réponse.
- Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Placez la souris anesthésiée sur sa face ventrale et fixez doucement chaque membre avec du ruban adhésif hypoallergénique pour créer une légère tension dans le membre à injecter. L’anesthésie est maintenue à l’aide d’isoflurane délivré par un vaporisateur de précision et un cône nasal.
- Nettoyez le site d’injection avec de la bétadine, puis à nouveau avec de l’alcool à 70 %. Répétez ce processus deux fois de plus. Assurez-vous qu’il ne reste pas de cheveux morts sur le terrain chirurgical.
- Faites une incision de 1 cm avec de petits ciseaux à environ 2 mm en dessous et parallèlement au fémur. Rétractez la peau avec une pince latéralement pour exposer les muscles en dessous.
- Le nerf sciatique est profond jusqu’aux muscles du grand fessier et du biceps fémoral. Séparez ces deux muscles le long d’un plan fascial avec de petits ciseaux et exposez le nerf sciatique en dessous. Libérez le nerf des muscles environnants à l’aide d’une dissection émoussée.
- Prélevez 3 μL de cellules cancéreuses (environ 50 000 cellules) de la pastille dans une seringue de 10 μL.
note: Vous pouvez également prélever 3 μL de PBS comme témoin.
- Placez une petite spatule métallique sous le nerf au point d’injection pour vous soutenir. Lors de la visualisation avec un microscope à dissection, insérez l’aiguille dans le nerf contre la base métallique, en gardant l’aiguille aussi parallèle que possible au nerf lors de l’insertion. Veillez à ne pas percer l’arrière du nerf. Minimisez autant que possible la manipulation du nerf tout au long de ce processus.
- Injecter lentement dans le nerf pendant 5 s. La formation d’un bulbe dans la zone d’injection indique une bonne injection. Laissez ensuite l’aiguille en place pendant 3 secondes avant de retirer délicatement l’aiguille. Le maintien de l’aiguille en place pendant 3 secondes minimise le reflux des cellules hors du nerf.
note: L’injection peut être effectuée vers le nerf distal ou la moelle épinière. Il est important de rester cohérent au sein d’un ensemble d’expériences. Si les cellules se déversent à l’extérieur, l’animal ne doit pas être inclus dans l’analyse de l’expérience. Avec l’expérience, ces événements sont très rares.
- Remettez le nerf dans sa position d’origine. Couvrez le nerf avec les muscles sus-jacents. Traitez les souris avec une analgésie appropriée, puis fermez la peau avec des sutures en nylon 5-0.
- Placez la souris seule dans une cage propre pour l’observer pendant la convalescence, jusqu’à ce qu’elle se réveille complètement de l’anesthésie.
note: Il faut 5 à 15 minutes pour que l’animal reprenne pleinement conscience. L’animal n’est pas laissé sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. L’animal n’est pas renvoyé à la compagnie d’autres animaux tant qu’il n’est pas complètement rétabli. Par la suite, évaluez la récupération au moins une fois toutes les 24 h pendant 72 h.
