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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Extraction du nerf sciatique
- Prenez des souris dont les nerfs sciatiques ont déjà été injectés avec des cellules cancéreuses et euthanasiez-les avec du CO2. Placez la souris sur sa face ventrale et stabilisez les membres distaux à l’aide d’épingles.
- Retirez la peau du côté dorsal du membre et du torse injectés.
- À l’aide d’une dissection émoussée, exposez le nerf sciatique profondément dans les muscles.
- Le nerf passe entre l’ilium et le sacrum. Pour avoir accès au nerf dans la région de la moelle épinière, séparez les deux os. Tout d’abord, insérez des ciseaux fermés dans la zone étroite où se trouve le nerf sciatique, puis ouvrez les ciseaux tout en tenant la souris. Soyez délicat et maintenez l’intégrité du nerf sciatique pendant la dissection.
- Disséquez soigneusement le nerf sciatique distalement jusqu’à l’extrémité du fémur et proximal à la moelle épinière.
note: Les nerfs envahis sont extrêmement fragiles et ont tendance à se briser sous tension ou lors d’une manipulation énergique.
- Récoltez le nerf en coupant d’abord son extrémité distale. Soulevez délicatement le nerf tout en le libérant des tissus adjacents. Coupez le nerf à l’extrémité proximale, le plus près possible de sa sortie de la colonne vertébrale.
- Enregistrer la durée brute de l’invasion à l’aide d’un pied à coulisse. Cette estimation macroscopique n’a qu’un caractère indicatif.
2. Traitement et quantification des nerfs
- Intégrez le nerf disséqué dans le composé OCT. Assurez-vous de placer les nerfs longitudinalement et aussi à plat que possible sur le fond du moule.
- Indiquez sur la cassette les côtés proximal et distal du nerf en marquant la lettre P (proximale) et D (distale).
- Placez les nerfs incrustés sur la glace sèche, s’ils ne sont pas sectionnés immédiatement. L’échantillon peut être conservé à -80 °C pendant plusieurs semaines.
- Sectionnez des échantillons à l’aide d’un microtome Cryostat de 5 μm d’épaisseur et placez des sections sur des lames de verre. Si possible, ajustez deux sections nerveuses par lame. Indique le côté proximal du nerf.
- Lames de teinture à l’aide d’une coloration H&E.
- Numérisez numériquement des sections nerveuses colorées à l’aide d’un scanner de diapositives qui fournit des données numériques haute résolution.
- À l’aide d’un logiciel d’imagerie, quantifiez la durée de l’invasion en cliquant sur le bouton de mesure de la distance, de la zone d’invasion ou d’autres paramètres souhaités. Pour une bonne estimation de la durée de l’invasion, utilisez plusieurs sections (2 à 4) du même nerf.