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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparer les souris pour l’injection de cellules tumorales
- Anesthésie une souris par injection intrapéritonéale (i.p.) d’un cocktail kétamine/xylazine (kétamine 100 mg/kg, xylazine 10 mg/kg).
- Confirmez l'anesthésie complète en pinçant les pattes de l'animal et observez l'absence de réponse.
- Placez la souris sur une plaque de verre (utilisée pour couler les gels de protéines) et fixez-la avec des élastiques.
- Si nécessaire, épilez les poils du cou en vous rasant ou en appliquant une petite quantité de produit dépilatoire et en essuyant les poils avec du papier absorbant.
note: Si vous utilisez des souris nues, sautez cette étape car elles n’ont pas de poils.
- Nettoyez la peau du cou en appliquant de la povidone iodée et de l’alcool à 70 %.
- Placez la souris sur la platine du microscope de dissection
- Faites une incision dans la peau de ~1 cm de long avec un scalpel chirurgical.
- Disséquez brutalement le muscle à l’aide d’une pince dentée pour exposer l’artère carotide en dessous.
- Séparez l’artère carotide du nerf vague adjacent à l’aide d’une pince chirurgicale.
- À l’aide d’une pince chirurgicale, séparez un peu de coton d’une boule de coton, humidifiez et façonnez en une boule de coton plus petite. Placez cette boule de coton hydratante sous l’artère carotide du site d’injection prévu.
- Placez une suture distale et proximale à la boule de coton et faites des nœuds lâches. Serrez le nœud proximal pour bloquer le flux sanguin dans le site d’injection.
- Procédez à l’injection de cellules cancéreuses si l’artère carotide de la boule de coton semble complètement pressurisée avec du sang rouge frais.
2. Injection de cellules cancéreuses dans l’artère carotide
- Vortex et aspirez 100 μL de cellules cancéreuses dans la seringue.
- Sous le microscope de dissection, insérez lentement l’aiguille 31G (avec biseau vers le haut) dans la lumière de l’artère carotide située au-dessus de la boule de coton.
- Injectez lentement les cellules de la seringue dans l’artère carotide. Le succès de l’injection peut être observé au microscope par la couleur changeante des vaisseaux sanguins et de la musculature voisins lorsque les cellules cancéreuses tamponnées sont poussées dans la circulation.
- Lorsque l’injection de tout le volume est terminée, soulevez doucement l’artère carotide distale pour éviter les régurgitations.
- Serrez rapidement le nœud distal pour terminer le processus d’injection.
- Une fois l’injection terminée, resserrez les ligatures et coupez l’excédent de suture de soie avec des micro-ciseaux sous le microscope de dissection. Reculez le muscle séparé pour couvrir le site de la plaie. Fermez la peau avec deux agrafes.
3. Récupération chirurgicale
- Déplacez l’animal opéré sur un coussin chauffant pour le récupérer. Cela peut prendre 30 à 60 minutes pour que les animaux reprennent conscience. Dans l’intervalle, administrer de la buprénorphine (0,05 mg/kg) par injection sous-cutanée comme analgésie post-chirurgicale.
note: L’analgésie doit être fournie conformément à votre protocole local approuvé par l’IACUC.
- Une fois que les animaux se réveillent et reprennent leur comportement normal, renvoyez les souris à leur lieu de logement. Donnez aux souris de la nourriture en gel pendant plusieurs jours après la chirurgie. Conservez un dossier chirurgical et conservez-le dans la pièce.
4. Imagerie In Vivo non invasive
- Pour les cellules marquées avec des constructions rapporteures de luciférase, mesurez l’efficacité d’injection des cellules cancéreuses à l’aide d’un système d’imagerie in vivo.
note: L’imagerie n’est pas réalisée le jour de l’injection pour éviter un stress excessif aux animaux de recherche.