Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Injection de la suspension tumorale dans le quatrième ventricule d’un embryon de 2-dpf
- Transférez 10 à 20 embryons déschorionnés anesthésiés à la périphérie de la plaque d’injection à l’aide d’une pipette de transfert ; Les embryons doivent tomber latéralement sur la plaque d’injection, avec les ventricules clairement visibles et accessibles. À l’aide d’une sonde inclinée, ajustez les embryons au besoin et éloignez-les du bord extérieur de la plaque d’injection.
- Chargez 1 à 2 μL de suspension de cellules tumorales dans l’aiguille d’injection à l’aide des pointes de pipette de chargement de gel et insérez l’aiguille dans le manipulateur.
- Abaissez manuellement le manipulateur en tenant l’aiguille à un angle de 45°. Ajustez les boutons du micromanipulateur dans les directions x, y et z jusqu’à ce que l’aiguille soit juste au-dessus et à environ 5 mm à droite de la tête de l’embryon. Regardez à travers les oculaires du stéréomicroscope et ajustez lentement le micromanipulateur dans la direction x jusqu’à ce que l’aiguille perce le quatrième ventricule de l’embryon. Ne laissez pas l’aiguille percer le cœur ou le jaune.
- Appuyez sur la pédale fixée au micro-injecteur pour injecter la suspension de cellules tumorales.
REMARQUE : La pression et le temps d’injection varient en fonction de la taille de l’alésage de l’aiguille, mais un bon point de départ est de 5 à 10 PSI et de 50 à 100 ms. Le volume de cellules tumorales injectées peut être évalué à l’aide de techniques standard de largage d’huile par injection dans de l’huile minérale, si nécessaire. Les injections de 500 pL avec un diamètre de goutte de 0,1 mm donnent généralement les meilleurs résultats.
- Rincer délicatement les embryons injectés de la plaque d’injection et les faire passer dans une boîte de Pétri à l’aide d’eau d’œuf fraîche (0,6 g/L de sel d’aquarium dans de l’eau d’osmose inverse + 0,01 mg/L de bleu de méthylène). Conservez les embryons dans l’eau de l’œuf pour les procédures restantes ou jusqu’à ce qu’ils soient cultivés dans des réservoirs.
- Inspectez les embryons injectés à l’aide d’un stéréomicroscope à fluorescence. Confirmez que la pression d’injection, l’angle, la taille de l’aiguille et la viscosité de la suspension cellulaire font que les cellules tumorales remplissent 25 à 50 % de l’espace ventricule. Ajustez ces paramètres si nécessaire.
- Répétez les étapes 1.1 à 1.5 pour tous les embryons restants. Anesthésie les embryons supplémentaires si nécessaire.
REMARQUE : Un utilisateur expérimenté peut injecter jusqu’à 300 embryons en 3-4 heures.
- Replacez les embryons dans l’incubateur à 28°C pendant la nuit.
- Le lendemain, évaluez la survie de l’embryon en examinant les caractéristiques morphologiques et physiologiques, telles que le développement normal du cœur et du cerveau, comme décrit.
