Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préconditionnement hypoxique des CSN humaines (Figure 1A)
- Cultiver les NSC sur plaque dans des flacons de culture T75 jusqu’à ce que la confluence soit atteinte à 90 %.
- Placez les flacons de culture cellulaire à l’intérieur d’une chambre/incubateur de CO2 humidifié avec des niveaux de 1 % d’O2 maintenus pendant 24 h, via une alimentation en gaz N2 contrôlée par un débitmètre intégré automatisé. Ces cellules sont appelées CSN H. Les CSNde contrôle N sont générées comme suit :
- Maintenir les CSN humaines (clones HB1.F3.CD) dans un milieu DMEM avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine dans un incubateur humidifié à 37 °C sous 95 % d’air ambiant et 5 % de CO2.
2. Chargement des CSN humaines avec le virus oncolytique (Figure 1B-1H)
- Infectez les CSN Net Havec 50 particules virales d’adénovirus réplicatif conditionnel (CRAd)-S-pk7 par cellule.
- Après 2 h d’incubation à température ambiante avec tapotement périodique, laver les cellules trois fois avec un milieu pour éliminer les particules virales non liées et suspendre les cellules dans une solution saline stérile pour injection.
prudence: Effectuer toutes les procédures de culture cellulaire in vitro liées au virus dans des installations ayant le niveau de biosécurité approprié, comme BSL2. Les chercheurs qui manipulent le virus oncolytique doivent porter un équipement de protection individuelle approprié, conformément aux lignes directrices des établissements vétérinaires.
3. Administration intranasale de CSN thérapeutiques (Figures 1D et Figure 2D)
- Cultiver et collecter des NSCs (NNSC, HNSC).
- Anesthésie des souris par injection intraveineuse d’un mélange de kétamine et de xylazine selon la procédure :
- Anesthésier l’animal en fonction de son poids corporel à l’aide des réactifs approuvés, c’est-à-dire soit par injection intrapéritonéale (i.p.) d’un mélange de kétamine (50 à 100 mg/kg ; consulter l’IACUC institutionnel pour la gamme de doses approuvée) et de xylazine (5 à 10 mg/kg ; consulter l’IACUC de l’établissement pour la gamme de doses approuvées) dans une solution saline stérile de 200 à 250 μL, ou par anesthésie à 4-5 % d’isoflurane à l’aide d’un dispositif d’inhalation.
- Placez les souris sur un rideau propre face vers le haut avec un coussin chauffant en dessous pour maintenir la température corporelle. Ajustez un oreiller rembourré fait d’essuie-tout enroulés avec des rubans adhésifs pour assurer l’angle droit des narines lorsqu’elles sont placées sous la tête de la souris.
- À l’aide d’une micropipette, versez 2 μL de suspension de NSC dans chaque narine de la souris. Confirmez visuellement l’aspiration de la gouttelette avant de passer à la souris suivante. Le nombre total de cellules livrées peut être déterminé par l’utilisateur ; utiliser 62 500 à 125 000 cellules/μL, de sorte que 0,5 à 1 million de cellules peuvent être administrées en doses de 4 x 2 μL.
- Utilisez une minuterie pour assurer des intervalles de 5 minutes entre chaque administration de suspension cellulaire, jusqu’à 4 fois.
- Permettez aux animaux de retrouver leur mobilité dans une chambre de récupération, en position couchée tout au long du processus.
