Génération de microtumeurs : une technique de culture in vitro pour cultiver des microtumeurs 3D afin d’analyser la réponse au traitement médicamenteux

Résumé

Source : Gilbert, A. N. et al. Génération de microtumeurs à l’aide d’un système de culture de biogel humain 3D et de cellules de glioblastome dérivées de patients pour le profilage kinomique et les tests de réponse aux médicaments. J. Vis. Exp. (2016)

Dans cette vidéo, nous générons des microtumeurs à partir de cellules tumorales dérivées de patients à l’aide de biogel humain 3D. Ces microtumeurs ressemblent beaucoup au microenvironnement tumoral in vivo et servent de plates-formes potentielles pour les tests de médicaments.

Protocole

1. Génération de microtumeurs

1. Préparation des réactifs
   1. Préparez le NBM complet en ajoutant les éléments suivants dans une bouteille de 500 ml de milieu neurobasal (NBM) pour préparer le NBM complet : 10 mL de supplément de B-27 sans vitamine A, 5 mL de supplément N2, 100 μL d’EGF, 100 μL de facteur de croissance des fibroblastes (FGF)-basique, 5 mL d’amphotéricine B, 0,5 mL de gentamycine, 5 mL de L-glutamine et préparez du biogel humain à haute densité neutralisé (HuBiogel) (HDHG à 3 mg/mL) selon le protocole interne. Des matrices de biogel similaires peuvent également être utilisées.
2. Production et culture de microtumeurs
   1. Obtenez des cellules PDX fraîchement dissociées en suspension cellulaire unique dans un NBM complet, sur de la glace.
   2. Mélanger la suspension cellulaire avec un volume égal de solution de bleu de trypan (0,4 % dans le PBS) et analyser à l’aide d’un hémocytomètre pour déterminer le nombre et la viabilité des cellules par exclusion du bleu de trypan. Prélever le volume nécessaire pour générer 50 000 cellules/microtumeur où volume = (50 000 cellules/tumeur * # tumeurs)/(nombre de cellules viables / 1 mL) et placer dans un tube conique frais.
   3. Concentrer les cellules par centrifugation à 150 x g, pendant 8 min, à température ambiante. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec une solution glacée de HDHG dans un rapport final de 1 partie de cellules dans FBS et de 4 parties de HDHG.
   4. À l’aide d’une pipette électronique multicanaux, il suffit de distribuer 10 μL de mélange de cellules HDHG par broche sur une plaque d’acier à 96 broches (avec revêtement hydrophobe) afin de générer des microtumeurs (billes de 2 mm contenant chacune 50 000 cellules).
   5. Placez les billes tumorales 3D à l’intérieur de l’incubateur de culture tissulaire (37 °C, 5 % CO₂, humidifié) pendant 15 min pour gélifier les billes.
   6. Après la gélification, transférez les microtumeurs (10 μL) dans une chambre de culture en suspension personnalisée (50 ml) ou une boîte de culture de grand volume (10 cm) contenant du NBM complet à l’aide de la pipette électronique multicanaux et d’un dispositif à broche personnalisé.
   7. Après 1 à 2 jours dans un incubateur de culture tissulaire, transférez les microtumeurs dans des plaques de culture à 96 puits contenant 50 μL de NBM/puits à l’aide d’une pipette distributrice à large bouche et effectuez divers protocoles de dosage et d’analyse.
3. Traitement médicamenteux et entretien des microtumeurs
   1. Sélectionnez les concentrations finales pour le dépistage de drogues.
      REMARQUE : Si le médicament a une efficacité connue en culture 2D, sélectionnez 2x la CI50 comme concentration de dose moyenne et sélectionnez 3 dilutions en série au-dessus et en dessous pour un total de 5 niveaux de dose. Par exemple, si la CI50 est de 9 μM pour le médicament en culture 2D, sélectionnez 2 μM, 6 μM, 18 μM, 54 μM et 162 μM comme concentration finale pour le test de médicament.
   2. Préparez une solution posologique de médicament 2x dans un NBM complet à partir d’un stock de diméthylsulfoxyde (DMSO). Diluer la solution de dosage dans un milieu à 1 % de DMSO pour préparer une dilution en série de 5 doses, en 3 fois.
   3. Ajouter 50 μL de solution doseuse dans le puits de microtumeur contenant 50 μL dans des plaques de dosage pour obtenir une concentration finale de DMSO de 0,5 %. Répéter l’opération pour chaque répétition (p. ex., 4) à chaque dose de médicament déterminée à l’étape 1.3.1.
   4. Maintenez les cultures dans un incubateur de culture de tissus humidifié à 37 °C, 5 % de CO₂, pendant 1 à 14 jours. Nourrir les cultures deux fois par semaine en actualisant le milieu et la solution médicamenteuse comme ci-dessus.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Collagénase-I	Sigma-Aldrich	CO130
Neurobasal-A	Technologies de la vie	Référence 10888-022
N-2 Supplément	Technologies de la vie	Référence 17502-048	1x concentration finale
Supplément de B-27 sans vitamine A	Technologies de la vie	Référence 12587-010	1x concentration finale
FGF humain recombinant basique	Technologies de la vie	PHG0266	Concentration finale de 10 ng/mL
L-Glutamine	Corning Cellgro Mediatech	Référence 25-005-CI	Concentration finale de 2 mM
gentamicine	Technologies de la vie	Référence 15750-060	Concentration finale de 50 ng/mL
Bleu trypan	Percer ThermoScientific	Référence 15250-061
Hubiogel haute densité	Vivo Biosciences	HDHG-5
Dmso	pêcheur	BP231	Pour la dissolution de la calcéine AM et des composés
Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco's avec Ca/Mg	Corning Cellgro Mediatech	20-030-CV	Dilué 1x avec de l’eau ultra-pure MiliQ (pour le lavage avant fixation)
10 % de formol tamponné neutre	protocole	Référence 032-060
Boîtes de Pétri en verre de 100 mm	pêcheur	Référence 08-748D