Induction du glioblastome à l’aide de la transposition médiée par SB : une technique de génération d’un nouveau modèle de souris à l’aide de l’intégration médiée par transposon du plasmide SB dans le cerveau d’une souris néonatale

Résumé

Source : Calinescu, A. A. et al. Intégration médiée par transposon de l’ADN plasmidique dans la zone sous-ventriculaire de souris néonatales pour générer de nouveaux modèles de glioblastome. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo décrit une technique efficace pour induire des glioblastomes (GBM) à l’aide d’ADN transposon injecté dans les ventricules de souris nouveau-nées. Les cellules de la zone sous-ventriculaire, qui absorbent le plasmide, se transforment, prolifèrent et génèrent des tumeurs présentant des caractéristiques histopathologiques du GBM humain.

Protocole

1. Injections néonatales intraventriculaires

1. Trois à quatre semaines avant l’expérience, installez une cage d’élevage de souris avec une souris mâle et une souris femelle, et un igloo de couleur plastique. Cela fournit un environnement enrichi et facilite le processus d’accouplement.
2. Lorsque la gestation est confirmée, retirez le mâle dans une nouvelle cage. Dix-huit jours après l’accouplement, surveillez quotidiennement la cage pour l’accouchement. Effectuer des injections intraventriculaires le jour 1 postnatal (P1).
3. Préparation de la solution injectable.
   REMARQUE : La solution d’injection est fabriquée en mélangeant l’ADN plasmidique avec le réactif de transfection pour créer les particules de transfection. Ci-dessous un exemple de préparation d’une solution injectable à l’aide d’un plasmide codant pour la transposase et la luciférase de la Belle au bois dormant : pT2/SB100x-Luc et deux plasmides de transposons : pT/CAGGS-NRASV12 et pT/CMV-SV40-LgT, dans un rapport de 1:2:2. Tous les plasmides ont une concentration de 2 μg/μL.
   1. Préparez la solution d’ADN en ajoutant : 4 μg (2 μL) de pT2/SB100x-Luc, 8 μg (4 μL) de pT/CAGGS-NRASV12 et 8 μg (4 μL) de pT/CMV-SV40-LgT et 10 μL de glucose à 10 % à un volume final de 20 μL à une concentration de 1 μg/mL d’ADN et 5 % de glucose.
   2. Préparez la solution de PEI en ajoutant 2,8 μL de jet d’EPI in vivo, 7,2 μL d’eau stérile et 10 μL de glucose à 10 % jusqu’à une concentration finale de 5 % de glucose.
   3. Ajouter la solution d’IPE à la solution d’ADN, mélanger et agiter au tourbillon et laisser reposer à température ambiante (RT) pendant 20 min. La solution est maintenant prête à être injectée. Après une heure à RT, gardez la solution sur de la glace.
   4. Insérez une seringue propre de 10 μL équipée d’une aiguille hypodermique 30G avec biseau de 12,5° dans la micropompe (Figure 1 #1).
4. Pour vérifier le bon fonctionnement du système d’injection, utilisez l’injecteur automatique (Figure 1 #1) pour prélever 10 μL d’eau dans la seringue puis vider complètement la seringue.
5. Refroidissez le stade stéréotaxique néonatal (Figure 1 #3) avec une boue de glace sèche et d’alcool à une température de 2 à 8 °C.
6. Induisez l’anesthésie en plaçant les petits sur de la glace humide pendant 2 min. L’anesthésie se poursuivra sur le cadre stéréotaxique réfrigéré pour le reste de la procédure. Le maintien de la température du cadre au-dessus du point de congélation, entre 2 et 8 °C, évitera les brûlures thermiques. Par mesure de précaution particulière, les chiots peuvent être enveloppés dans de la gaze avant de les placer sur de la glace humide.
7. Remplissez la seringue avec la solution d’ADN/PEI.
8. Immobilisez le chiot dans le cadre stéréotaxique en plaçant sa tête entre les barreaux d’oreille recouverts de gaze (figure 1b). Assurez-vous que la face dorsale du crâne est horizontale, parallèle à la surface du cadre et que les sutures crâniennes sont clairement visibles. Essuyez la tête avec de l’éthanol à 70 %.
9. Abaissez l’aiguille de la seringue et ajustez les coordonnées stéréotaxiques à l’aide des cadrans du cadre stéréotaxique jusqu’à ce que l’aiguille touche la lambda (l’intersection médiane des os pariétal et occipital) (Figure 1b).
10. Soulevez l’aiguille et ajustez les coordonnées stéréotaxiques à 0,8 mm sur le côté et à 1,5 mm sur la rostrale par rapport au lambda (Figure 1b).
11. Abaissez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle touche et creuse légèrement la peau. Mesurez les coordonnées. Abaissez l’aiguille de 1,5 mm supplémentaire. L’aiguille transpercera la peau et le crâne, et traversera le cortex pour pénétrer dans le ventricule latéral (Figure 1c).
12. À l’aide de l’injecteur automatique, injecter 0,75 μL de la solution d’ADN/PEI à un débit de 0,5 μL/min.
13. Gardez le chiot sur le cadre pendant une minute supplémentaire pour permettre à la solution de se disperser dans les ventricules. Pendant ce temps, anesthésez un autre chiot, sur de la glace pendant 2 min en préparation de la prochaine injection.
14. Soulevez doucement et lentement l’aiguille et placez le chiot sous une lampe chauffante. Surveillez la respiration et l’activité. Si nécessaire, fournissez une stimulation douce des membres jusqu’à la première respiration.
15. Renvoyez le petit à sa mère après qu’il se soit réchauffé, qu’il ait atteint une couleur rose, qu’il respire régulièrement et qu’il soit actif, normalement de 5 à 7 minutes. Si plus d’un chiot est injecté à la fois, gardez tous les chiots ensemble jusqu’à ce que toutes les injections soient faites. Si les injections durent plus de 30 minutes, retournez la moitié des petits après les 30 premières minutes et le reste à la fin de la procédure.
16. Veillez à ce que la mère soit réactive et nourricière pour ses petits. Si nécessaire, ajoutez une mère porteuse dans la cage.
17. Assurez-vous que l’intervalle entre le moment où le chiot est placé sur de la glace et celui où il est placé sous la lampe chauffante est inférieur à 10 minutes. Plus la procédure est rapide, meilleure est la survie. Habituellement, le temps nécessaire pour anesthésier et injecter un chiot est de 4 min.

Résultats

Figure 1 : Dispositif expérimental et guides pour les injections intra-ventriculaires chez la souris néonatale. a)Un cadre stéréotaxique (2) avec cadrans micrométriques est équipé d’un injecteur automatique tenant une seringue de 10 μl (4). À l’intérieur du cadre en U, un cadre adaptateur néonatal est solidement fixé (3). Le panneau de commande de l’injecteur automatique (1) p...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Norme de laboratoire de Stoelting avec adaptateurs pour rats et souris	Stoelting	Référence 51670	D’autres sociétés produisent des cadres similaires, tous ceux avec de petits adaptateurs de souris conviennent
Injecteur stéréotaxique par excellence (QSI)	Stoelting	Référence 53311	Les injections peuvent être effectuées sans lui, mais l’injecteur automatique permet une reproductibilité et une commodité accrues
Seringue MICROLITER de 10 μL série 700 montée à la main	Hamilton	Modèle 701	Ce modèle de seringue délivrera de 0,5 à 500 μL de solution de manière fiable. D’autres seringues (par exemple 5 μL , modèle 75) peuvent également être utilisées
Aiguille hypodermique de calibre 30 (1,25", biseau 15^{o})	Hamilton	S/O# 197462	Cette aiguille est idéale pour percer la peau et le crâne d’une souris néonatale sans avoir besoin d’autres procédures invasives. S'il devient terne (ne pénètre pas facilement dans la peau), il doit être remplacé.
Jet in vivo PEI	Transfection Polyplus	201 à 10 g	Aliquote en petits volumes et conserver à -20ºC
D-luciférine, sel de potassium	Goldbio.com	LuckK-1g	D’autres sources de luciole lucifierase sont tout aussi adéquates
Solution d’hématoxyline, modifiée par Harris	Sigma Aldrich	HHS128-4L