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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Dissection
REMARQUE : Les conditions stériles ne sont pas requises à moins que des récipients ne soient utilisés à des fins de culture cellulaire. Préparer des solutions pour récipients d’isolement : B1, ajouter 1,5 mL de HEPES 1M à 150 mL de HBSS ; B2, ajouter 3,6 g de Dextran à 20 mL de B1 ; B3, ajouter 1 g de BSA à 100 mL de B1.
- Préparez un bécher de 150 mL avec 20 mL de B1. Garder sur la glace et couvrir de parafilm pour éviter la contamination de l’air.
- Anesthésez profondément la souris sous une cagoule à l’aide d’un petit essuie-tout imbibé de 1 ml d’isoflurane pur que l’on ajoute dans la cage. L’anesthésie est vérifiée par l’absence de réaction à un pincement de l’orteil. Tuez la souris par luxation cervicale.
note: Ces étapes sont accomplies dans le respect des réglementations nationales et institutionnelles.
- Facultatif : Effectuer une perfusion intracardiaque avec 20 mL de PBS 1x pour éliminer le contenu sanguin.
- Séparez la peau avec un scalpel du cou au nez et retirez-la. Éliminez tous les poils contaminants avec PBS 1x.
- Pour ouvrir le crâne, insérez d’abord les ciseaux à l’avant du bulbe olfactif et ouvrez les ciseaux pour rompre le crâne en deux parties.
- Retirez délicatement le cerveau à l’aide d’une spatule cérébrale. Disséquez le plexus choroïde des ventricules latéraux car ils contamineraient la préparation des vaisseaux sanguins.
note: Facultatif : La préparation finale contiendra des vaisseaux parenchymateux et méninges. Si ce n’est pas le cas, les méninges peuvent être décollées.
- Transfère le cerveau dans le bécher contenant la solution B1 sur glace. Jusqu’à 8 cerveaux peuvent être traités ensemble.
2. Homogénéisation du tissu cérébral
- À l’aide de deux scalpels, frappez manuellement et vigoureusement le cerveau dans la solution B1, obtenant ainsi de petits morceaux d’environ 2 mm.
- Homogénéisez la préparation avec un homogénéisateur Dounce automatisé, en effectuant 20 coups à 400 tr/min. Assurez-vous que le tube de verre est maintenu dans la glace et que la partie supérieure du bec est en solution lors des mouvements de haut en bas, afin d’éviter la formation de poches d’air. Si plusieurs échantillons sont préparés, laver le dénonciateur à l’eau ionisée entre chaque homogénéisation.
3. Purification des récipients
- Transvaser l’homogénat dans un tube en plastique de 50 mL et procéder à la centrifugation à 2 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Une grande interface blanche (principalement de la myéline) se formera sur le dessus de la pastille vasculaire (rouge si aucune perfusion n’a été effectuée).
- Jetez le surnageant. Le granulé de récipient et l’interface blanche resteront attachés ensemble. Ajouter 20 mL de solution B2 glacée et agiter le tube manuellement et vigoureusement pendant 1 min.
- Procéder à la deuxième centrifugation à 4 400 x g pendant 15 min à 4 °C. La myéline va maintenant former une couche blanche dense à la surface du surnageant.
- Détachez soigneusement la couche de myéline des parois du tube en tenant le tube et en le tournant lentement pour permettre au surnageant de passer le long des parois. Jetez la myéline avec le surnageant. La pastille contenant les récipients reste attachée au fond du tube.
- Épongez la paroi intérieure du tube avec un papier absorbant enroulé autour d’une pipette en plastique de 5 ml et retirez tous les fluides résiduels, évitez de toucher la pastille du récipient. Gardez le tube à l’envers sur un papier absorbant pour évacuer le liquide restant.
- Mettez la pastille en suspension dans 1 mL de solution B3 glacée en pipetant de haut en bas avec des embouts à faible liaison, en gardant le tube sur de la glace, puis ajoutez 5 mL de solution B3 supplémentaire. Assurez-vous que les récipients sont dispersés autant que possible et ne forment pas de regroupements.
4. Filtration
- Préparez un bécher sur glace avec 30 ml de solution B3 glacée. Couvrir d’un parafilm pour éviter la contamination de l’air.
- Placez un filtre à mailles de 20 μm sur un porte-filtre modifié sur le dessus d’une fiole Becker et équilibrez en appliquant 10 ml de solution B3 glacée
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- Versez la préparation du récipient sur le filtre et rincez les récipients avec 40 ml de solution B3 glacée
.
- Récupérez le filtre à l’aide d’une pince propre et plongez-le immédiatement dans le bécher contenant la solution B3. Détachez les récipients du filtre en le secouant doucement.
- Verser le contenu du bécher dans un tube en plastique de 50 mL et centrifuger à 2 000 x g pendant 5 min à 4°C.
note: Alternativement, la suspension des vaisseaux cérébraux de l’étape 3.6 peut être filtrée sur un filtre à mailles de 100 μm. Dans ce cas, les récipients plus grands sont préférentiellement retenus sur le filtre tandis que le flux contient des microrécipients (principalement des capillaires), qui sont ensuite filtrés sur un filtre à mailles de 20 μm comme ci-dessus.
- Remettre en suspension la pastille de microvaisseaux dans 1 mL de solution B3 glacée et la transférer en la pipetant dans un tube Eppendorf de 1,5 mL. Centrifugeuse à 2 000 x g pendant 5 min à 4 °C.