Dosage de la phagocytose in vitro : une méthode basée sur l’imagerie en direct pour étudier la phagocytose des synaptosomes médiée par les astrocytes en temps réel

Résumé

Source : Byun, Y. G., Chung, W. S. Un nouveau test d’imagerie en direct in vitro de la phagocytose médiée par les astrocytes à l’aide de synaptosomes conjugués à l’indicateur de pH. J. Vis. Exp. (2018)

Dans cette vidéo, nous évaluons la capacité phagocytaire d’astrocytes purifiés in vitro par un test d’imagerie en direct. Le test sert de plate-forme de criblage efficace pour identifier les composés chimiques qui peuvent améliorer ou inhiber la capacité phagocytaire des astrocytes.

Protocole

1. Dosage de la phagocytose en direct (Figure 1)

1. Préparez une plaque à 24 puits (ou toute plaque/plat préparé pour l’imagerie en direct) dans laquelle les astrocytes sont confluents (généralement, 7 à 10 jours d’incubation après la purification sont idéaux pour stabiliser les cellules).
2. Retirez le milieu de chaque puits et lavez-les avec 1 ml de solution saline tampon phosphate de Dulbecco (DPBS), trois fois. Pour minimiser l’exposition à l’air, lavez les puits rapidement.
3. Ajoutez 300 μL de milieux basiques pour astrocytes immunopanés (IP-ABM) avec 5 μL de synaptosomes conjugués à des indicateurs de pH et des facteurs supplémentaires tels que des milieux conditionnés par des astrocytes immunopanés (IP-ACM) qui peuvent moduler la phagocytose des cellules gliales.
4. Incuber la plaque dans un incubateur de CO₂ pendant 40 min. Cette étape permet aux synaptosomes conjugués à l’indicateur de pH de se déposer au fond des plaques.
5. Retirez le milieu contenant des synaptosomes conjugués à un indicateur de pH non liés et lavez chaque puits avec 1 mL de DPBS, trois fois.
   prudence: Ne pas laver durement. Pour minimiser l’exposition à l’air, lavez les puits rapidement.
6. Ajouter 500 μL d’IP-ABM avec des facteurs supplémentaires à tester dans les puits.
7. Apportez la plaque à un instrument d’imagerie en direct et sélectionnez les positions. Ajustez la mise au point, le temps d’exposition, la luminosité et la puissance des LED.
   note: Les paramètres du temps d’exposition, de la luminosité et de la puissance de la LED varient en fonction de l’intensité de la fluorescence et de l’objectif de l’expérience. Dans le test d’imagerie en direct avec des synaptosomes conjugués à des indicateurs de pH, nous définissons généralement ces valeurs comme suit : exposition : ~150-200 ms, luminosité : 15 et puissance de la LED : 4-6.
8. Définissez le format d’image, l’intervalle de temps et le nombre total de cycles pour l’imagerie en direct. Réglez l’intervalle de temps sur 1 ou 2 h en fonction du nombre de positions sélectionnées. Des intervalles de 2 heures sont recommandés lorsque plus de 150 positions sont sélectionnées pour l’imagerie en direct.
9. Démarrez les expériences d’imagerie en direct.

Résultats

Graphique 1. Schéma du test d’imagerie en direct de phagocytose.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
pHrodo rouge, ester succinimidylique	Sondes Molecula	Réf. P36600	Pour la conjugaison d’indicateurs de pH
Sérum fœtal bovin (FBS)	Gibco	Référence 16000-044
DMEM	Gibco	Référence 11960-044
dPBS	Welgene	LB001-02
Test d’imagerie en direct de la phagocytose
Stade Juli	NanoEntek
Plug-ins Time Series Analyzer V3	https://imagej.nih.gov/ij/plugins/ time-series.html