Électroporation ex vivo de tranches cérébelleuses d’embryons de poulet : une méthode d’introduction d’ADN plasmidique codant pour une protéine fluorescente verte pour visualiser le développement cellulaire granulaire

Dans cet article

Résumé

Source : Hanzel, M. et al.Culture ex vivo de tranches cérébelleuses de poussin et électroporation spatialement ciblée de précurseurs de cellules granulaires.J. Vis. Exp. (2015)

Dans cette vidéo, nous effectuons l’électroporation de tranches de cervelet d’embryons de poulet avec des plasmides de gènes rapporteurs. La technique facilite la visualisation du développement et de la migration des précurseurs de cellules granulaires pour former une couche granulaire.

Protocole

1. Électroporation des tranches

Construisez une chambre d’électroporation en fixant l’anode d’un électroporateur à la base d’une boîte de Pétri de 60 mm avec du ruban isolant. Ajouter environ 1 mL de HBSS pour couvrir l’électrode.
Placez un insert de culture de 0,4 μm sur l’électrode recouverte de HBSS. Laissez l’insert de culture reposer sur l’électrode en vous assurant qu’il y a toujours un contact entre l’insert et l’électrode.
note: Dans cette configuration, l’insert de culture avec les tranches reposera sur la surface de la solution, maintenant le circuit mais permettant un ciblage spatial de la cathode.
Transférez les tranches identifiées (jusqu’à cinq par insert de culture) sur l’insert de culture à l’aide d’une pipette Pasteur de 3 mL avec la pointe coupée. Séparer et laisser reposer sur l’insert de culture dans une orientation sagittale.
À l’aide d’une pipette, retirez l’excès de HBSS afin que les tranches ne soient plus baignées dans la solution.
À l’aide d’une pointe de pipette P10, pipetez l’ADN (à une concentration de 1 μg/μL) dilué avec 20 % de vert rapide sur la surface de la région ciblée d’une tranche. 20 % de vert rapide assure une solution visqueuse de l’ADN et empêche une dispersion prohibitive de l’ADN. Ajouter environ 5 μL d’ADN/solution verte rapide à chaque tranche (figure 1B).
Placez la cathode sur le tissu ciblé souhaité et électroporate avec 3 impulsions de 10 V d’une durée de 10 ms. Évitez le contact direct de la cathode avec le tissu. Au lieu de cela, profitez de la tension superficielle du liquide pour maintenir la conductance (placez la cathode aussi près que possible du tissu sans toucher réellement le tissu).
Répétez l’administration de l’ADN et l’électroporation dans plusieurs régions de l’EGL sur chaque tranche cérébelleuse individuelle si vous le souhaitez.
Une fois l’électroporation terminée, transférer l’insert de culture dans une boîte de Pétri de 30 mm.
À chaque culture, ajouter 1 mL de milieu de culture préchauffé (Basal Medium Eagle, 0,5 % (p/v) de D-(+)-glucose, 1 % de supplément de B27, 2 mM de L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine) sous l’insert de culture de sorte que l’insert de culture soit en contact avec le milieu, mais que les tranches n’y baignent pas.
Incuber les cultures à 37 °C/6 % de CO₂ pendant 3 jours maximum. Remplacez tout le milieu de culture toutes les 24 heures par un milieu frais préchauffé.
Après la culture, fixer les tranches sur les inserts de culture pendant 1 heure dans du paraformaldéhyde à 4 % (ou O/N à 4 °C) dans une boîte fraîche de 30 mm sans milieu de culture.

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Résultats

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Figure 1. La mise en place de la chambre d’électroporation. (A) Une photo de la chambre d’électroporation sur mesure. La chambre est constituée d’une anode d’un électroporateur placée solidement sur la base d’une boîte de Pétri de 60 mm. La boîte contient environ 1 ml de HBSS pour couvrir l’électrode. L’insert de culture doit reposer sur l’électrode avec un co...