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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de la dissection et des sections du cervelet (temps de manipulation ≈ 15 à 20 minutes par animal)
- Placez l’une des boîtes de culture cellulaire de 60 mm contenant le milieu de dissection glacé sous le microscope binoculaire et retirez la plaque supérieure.
- Tamponnez la fourrure de la tête avec de l’éthanol à 70 % (en évitant soigneusement de toucher les yeux de l’animal) et décapitez l’animal à l’aide de gros ciseaux tranchants, conformément à la procédure approuvée.
REMARQUE : Les tranches cérébelleuses sont générées à partir de souris P9-P10 sans aucun biais spécifique de sexe ou de souche.
- À l’aide de petits ciseaux, coupez la peau le long de la ligne médiane de la tête, en partant du cou et en remontant jusqu’au museau de la souris.
- Pour tenir la tête et exposer le crâne, repliez la peau ventralement sous la tête et pincez les deux plis de peau entre vos doigts.
- Insérez doucement les petits ciseaux dans le foramen magnum et coupez le crâne en faisant une incision latérale vers le côté, puis coupez tout autour de la tête du crâne. Gardez la pointe des ciseaux aussi parallèle et proche que possible du crâne pendant la coupe, pour éviter d’endommager le tissu cérébral.
- Récupérez la partie dorsale du crâne à l’aide d’une pince fine et droite. Tout en soulevant soigneusement la partie dorsale du crâne, coupez les méninges adhérentes (membrane irriguée translucide entourant le tissu cérébral) si nécessaire avec de petits ciseaux pour éviter d’endommager le tissu cérébral.
- Introduisez avec précaution une pince fine et droite (ou utilisez une spatule) entre le crâne ventral et le cerveau, retournez doucement le cerveau et coupez les nerfs optiques et trijumeaux avec de petits ciseaux.
- Aidez le cerveau à plonger par gravité dans la boîte de culture cellulaire de 60 mm contenant un milieu de dissection glacé en tournant la tête à l’envers juste au-dessus de la boîte et en relâchant les dernières adhérences avec de petits ciseaux si nécessaire.
- À l’aide d’une pince fine, orientez le cerveau avec la face dorsale tournée vers le chercheur et la face ventrale située au fond de la boîte.
- Sous le microscope binoculaire, utilisez la pince fine-droite pour immobiliser le cerveau du côté du cerveau antérieur et évitez de toucher le cerveau arrière, car il pourrait être endommagé. Séparez le cerveau postérieur du reste du cerveau (cerveau antérieur et mésencéphale, voir schéma sur la figure 1Aa), à l’aide d’une pince fine et droite. Pour séparer le cervelet du reste du cerveau postérieur, à l’aide de la pince fine, coupez les pédoncules cérébelleux sous le cervelet (voir schéma sur la figure 1Aa').
- Une fois le cervelet isolé, arrachez soigneusement les méninges à l’aide d’une pince fine et droite (voir schéma sur la figure 1Aa').
- Tenez doucement le cervelet à l’aide de la pince fine et incurvée, placez-le avec le côté dorsal vers le haut sur la plate-forme en plastique perpendiculairement à la lame de rasoir du hachoir (voir schéma sur la figure 1Bb).
- Aspirer tout excès de milieu de dissection autour du cervelet à l’aide d’une pointe de pipette stérile à bout fin adaptée sur une pipette de 1 mL (voir schéma sur la figure 1Bb).
- S’assurer que le cervelet repose à plat, mais n’est pas étiré, une fois placé sur la plate-forme pour obtenir des coupes sagittales optimales lors de la section (voir schéma sur la figure 1Bb).
- Coupez des coupes sagittales de 300 m d’épaisseur du cervelet à l’aide du hachoir à tissus (voir schéma sur la figure 1Bb'). La force et la vitesse de la lame doivent être optimisées sur place.
- Ajoutez délicatement une goutte de milieu de dissection sur le cervelet tranché. À l’aide d’une pointe de pipette de large calibre placée sur une pipette de 1 mL, aspirez lentement le cervelet tranché et transférez-le à nouveau dans la boîte de culture cellulaire de 60 mm contenant un milieu de dissection glacé (voir schéma sur la figure 1Bb'').
- Nettoyez la plate-forme en plastique du hachoir à tissus avec de l’éthanol à 100 % entre chaque tranchage du cervelet. Laissez l’éthanol s’évaporer avant de placer le cervelet suivant sur la plate-forme.
- À l’aide de deux pinces fines et droites (ou d’aiguilles en titane), séparez les tranches individuelles et sélectionnez 6 à 8 tranches dans le vermis (voir schéma sur les figures 1Cc et 1Cc').
- Prenez une plaque à 6 puits avec des inserts de culture et transférez jusqu’à 4 tranches sélectionnées sur un insert de culture avec un milieu de dissection, à l’aide d’une pointe de pipette de grand calibre adaptée sur une pipette de 1 mL (voir schéma sur la figure 1Cc').
- Placez les tranches au milieu de l’insert de culture à l’aide du milieu de dissection ou d’une pince pour les pousser et les tirer doucement au bon endroit, en évitant qu’elles ne soient en contact les unes avec les autres (voir schéma sur la Figure 1Cc').
- Retirez tout excès de milieu de dissection autour des tranches à l’aide d’une pointe de pipette à extrémité fine. S’assurer que les tranches sont à plat sur la membrane (voir schéma sur la figure 1Cc').
- Placez la plaque à 6 puits dans l’incubateur immédiatement après avoir ajouté les tranches sur la membrane.
