Électroporation de cellules uniques dans des cultures de tranches de cerveau organotypiques : une technique in vitro pour délivrer des plasmides à l’intérieur de neurones ciblés dans des coupes d’hippocampe cérébral

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation de la culture en tranches

1. Préparez des cultures de coupes organotypiques d’hippocampe de souris en utilisant des souris postnatales âgées de 6 à 7 jours des deux sexes.
   1. Préparez un milieu de dissection pour la culture en coupe organotypique composé de (en mM) : 238 saccharose, 2,5 KCl, 1 CaCl₂, 4 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ et 11 glucose dans de l’eau désionisée, puis un gaz avec 5 % de CO₂/95 % O₂ à un pH de 7,4.
   2. Préparez un milieu de culture en tranches organotypiques composé de : 78,8 % (v/v) Minimum Essential Medium Eagle, 20 % (v/v) de sérum de cheval, 17,9 mM de NaHCO₃, 26,6 mM de glucose, 2 M de CaCl₂, 2 M de MgSO₄, 30 mM HEPES, d’insuline (1 μg/mL) et 0,06 mM d’acide ascorbique, pH ajusté à 7,3. Ajustez l’osmolarité à 310-330 osmol à l’aide d’un osmomètre.
   3. Disséquez l’hippocampe de tout le cerveau à l’aide de deux spatules et coupez-le (400 μm) à l’aide d’un hachoir à tissus. Séparez les tranches à l’aide de deux pinces et transférez-les dans des inserts de culture cellulaire de 30 mm dans une plaque à 6 puits remplie de milieu de culture (950 μL) sous les inserts.
2. Conservez les cultures de coupes organotypiques dans un incubateur de culture tissulaire (35 °C, 5 % de CO₂) et changez le milieu de culture en tranches tous les deux jours.

2. Préparation du plasmide

1. Préparez le plasmide pour le gène d’intérêt.
   1. Sous-clonez le gène EGFP (Green Fluorescent Protein) dans un vecteur pCAG.
   2. Purifier le plasmide pCAG-EGFP à l’aide d’un kit de purification exempt d’endotoxines et le dissoudre dans une solution interne composée d’eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle contenant 140 mM de K-méthanesulfonate, 0,2 mM d’EGTA, 2 mM de MgCl₂ et 10 mM d’HEPES, ajustés à pH 7,3 avec KOH (concentration du plasmide : 0,1 μg/μL).

3. Préparation des pipettes en verre

1. Tirez des pipettes en verre borosilicate (4,5 à 8 MΩ) sur un extracteur de micropipettes (Figure 1A).
   note: Les pipettes en verre utilisées pour l’enregistrement de cellules entières sont idéales pour l’électroporation.
2. Faites cuire les pipettes en verre pendant la nuit à 200°C pour les stériliser.
3. Vérifiez la taille de la pointe de la pipette à l’aide d’un microscope de dissection pour estimer la résistance électrique.
   1. Facultatif : Vérifiez la résistance de la pipette en fixant la pipette à l’électrode d’électroporation et utilisez le micromanipulateur pour manœuvrer la pointe de la pipette dans du liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) stérilisé par filtre contenant (en mM) : 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl₂, 5 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ et 11 glucose dans de l’eau désionisée, gazée avec 5 % de CO₂/95 % O₂à un pH de 7,4. Confirmez la résistance réelle à l’aide de l’affichage sur l’electroporator.
      note: Plus la pointe de la pipette est pointue, plus la résistance électrique est importante. La résistance de la pipette doit être inférieure à 10 MΩ. Les pipettes en verre à haute résistance (Figure 1B) se bouchent souvent à l’extrémité lors d’électroporations répétées.

4. Configuration de la plate-forme d’électroporation

1. Installez l’électroporateur sur un appareil d’électrophysiologie standard à cellules entières, équipé d’un microscope vertical monté sur une table mobile avec un micromanipulateur et une pompe péristaltique.
2. Installez la tête de l’électroporateur sur un micromanipulateur et connectez une paire de haut-parleurs à l’électroporteur. Connectez l’électroporateur à une pédale qui peut être utilisée pour envoyer une impulsion lorsqu’elle est prête.
   note: Les haut-parleurs émettent une tonalité lorsqu’ils sont allumés, ce qui est un indicateur de la résistance électrique au niveau de l’électrode. Cela permet de déterminer les changements relatifs de résistance sans détourner l’attention de la procédure.

5. Préparation par électroporation

1. Transférez les inserts de culture en tranches des plaques à 6 puits dans des boîtes de Pétri de 3 cm chargées de 900 μL de milieu de culture et stockez-les dans un incubateur de CO₂ de table jusqu’à ce qu’ils soient prêts à effectuer l’électroporation.
   1. Préincuber des inserts de culture frais avec un milieu de culture en tranches (1 mL) pendant au moins 30 minutes dans une boîte de Pétri de 3,5 cm pour cultiver les tranches après électroporation.
2. Nettoyez et préparez la plate-forme pour l’électroporation.
   1. Perfuser les lignes avec de l’eau de Javel à 10 % pendant 5 minutes pour stériliser le tube et la chambre avant de commencer l’expérience pour la journée.
   2. Perfuser les conduites avec de l’eau autoclavée désionisée pendant au moins 30 minutes pour rincer complètement.
   3. Perfuser les lignes avec de l’aCSF stérilisé par filtre contenant 0,001 mM de tétrodotoxine (TTX).
      note: Le TTX minimise la toxicité cellulaire et la mort due à la surexcitation des interneurones.
3. Réglez les paramètres d’impulsion de l’électroporateur : amplitude de –5 V, impulsion carrée, train de 500 ms, fréquence de 50 Hz et largeur d’impulsion de 500 μs.
4. Remplissez la pipette en verre de 5 μL de solution interne contenant du plasmide.
   1. Retirez toutes les bulles d’air emprisonnées dans la pointe de la pipette en effleurant et en tapotant doucement la pointe plusieurs fois.
   2. Vérifiez que la pointe n’est pas endommagée en la visualisant au microscope de dissection ou en répétant l’étape 3.3.1 pour vérifier la résistance de la pipette.
      note: Si l’embout est endommagé, la pipette en verre doit être jetée, et cette étape doit être répétée avec une nouvelle pipette en verre préalablement préparée à l’étape 3.
5. Fixez solidement la pointe de la pipette à l’électrode et allumez les haut-parleurs. Enregistrez la lecture (résistance de la pipette) de l’électroporateur lorsque la pointe est entrée en contact avec le milieu aCSF.
6. Coupez la membrane de l’insert de culture à l’aide d’une lame tranchante et isolez une tranche de culture. Transférez soigneusement la culture de tranches dans la chambre d’électroporation à l’aide d’une pince à angle vif et fixez sa position avec un ancrage de tranche.
   1. Ne gardez pas la culture de tranche à l’extérieur de l’incubateur pendant plus de 30 minutes à la fois pour prévenir les effets secondaires tels que des changements dans la santé ou la fonction neuronale.

6. Cellules électroporatiques d’intérêt

1. Appliquez une pression positive sur la pipette à l’aide de la bouche ou à l’aide d’une seringue de 1 mL (pression de 0,2 à 0,5 mL) fixée à la tubulure.
2. Utilisez les commandes à bouton 3 dimensions du micromanipulateur pour manœuvrer la pointe de la pipette près de la surface de la culture en tranches.
3. Choisissez une cellule cible et approchez-vous-en, en maintenant la pression positive appliquée jusqu’à ce qu’une fossette se forme à la surface de la cellule, visible au microscope.
4. Effectuez des cycles de pression.
   1. Appliquez rapidement une légère pression négative par la bouche de sorte qu’un joint lâche se forme entre la pointe de la pipette et la membrane plasmique, ce qui est indiqué visuellement par la membrane qui remonte quelque peu dans la pointe de la pipette. Observez une augmentation (~2,5 fois la résistance initiale) de la résistance de la pipette en écoutant une augmentation de la tonalité provenant des haut-parleurs. Réappliquez rapidement une pression positive pour que la fossette se reforme.
   2. Effectuez immédiatement au moins deux cycles de pression supplémentaires sans pause, puis maintenez une pression négative pendant 1 s.
      note: Faire une pause entre les cycles, appliquer trop de pression ou maintenir la pression négative trop longtemps peut causer des dommages importants à la cellule et éventuellement provoquer la mort de la cellule pendant l’électroporation.
5. Pulsez rapidement l’électroporateur une fois à l’aide de la pédale lorsque la tonalité des haut-parleurs atteint un sommet stable en hauteur, indiquant une résistance électrique maximale. N’attendez pas plus de 1 s à la résistance de crête avant d’envoyer le pulse.
   note: Nous n’avons observé aucune électroporation hors cible lors de l’utilisation de ce protocole. Seules les cellules en contact avec la pipette en verre pendant les cycles de pression ont été transfectées. Le positionnement de la pipette à proximité d’autres neurones n’entraîne pas de transfection de gènes.
6. Rétractez doucement la pipette à environ 100 μm de la cellule sans appliquer de pression.
7. Réappliquez une pression positive, en vérifiant que la résistance est similaire à l’affichage enregistré à l’étape 5.5, puis approchez-vous de la cellule suivante.
   1. Éliminez les obstructions potentielles, indiquées visuellement ou par une résistance de pipette considérablement accrue (>15 % plus élevée) après électroporation, en appliquant une pression positive.
      note: S’il n’y a pas de bouchon visible et que la résistance est encore nettement plus élevée, jetez la pipette et utilisez-en une neuve. En moyenne, une pipette peut être utilisée pour jusqu’à 20 événements d’électroporation si l’utilisateur est prudent.

Après l’électroporation, transférez la culture en tranches sur un insert de culture frais et incubez à 35°C dans l’incubateur jusqu’à 3 jours.

Figure 1 : Deux images représentatives de pipettes en verre. (A) Affichez des pipettes à résistance inférieure (6,5 MΩ), utilisées dans ce protocole, et (B) des pipettes à résistance plus élevée (10,4 MΩ) typiques des protocoles d’électroporation.

Figure 2 : Des cultures de tranches d’hippocampe organotypiques ont été électroporées avec de l’EGFP (vert) à trois moments différents. (A) Culture représentative de tranches organotypiques d’hippocampe chez une souris DIV7 Pv/TdTomato. Les neurones pyramidaux CA1 ont été électroporés avec EGFP (pointes de flèches vertes, blanches) et n’ont montré aucun chevauchement avec les interneurones Pv positifs à TdTomato (TdT) (pointes de flèches rouges, jaunes). Une contre-coloration nucléaire DAPI (bleu) a été réalisée. DG : gyrus denté. (B–D) Les neurones pyramidaux CA1 ont été électroporés avec EGFP à trois moments différents : (B) DIV7, (C) DIV14 et (D) DIV21. Les cultures en tranches organotypiques ont été fixées avec 4 % de saccharose, 4 % de paraformaldéhyde/1x PBS et imagées sans autre section. En haut à gauche, images à faible grossissement de la zone CA1 de l’hippocampe. Les pointes de flèches représentent des neurones pyramidaux CA1 individuels ciblés pour l’électroporation. Les neurones transfectés avec des pointes de flèches jaunes sont zoomés dans les panneaux inférieurs. Les pointes de flèches blanches signifient des neurones électroporés supplémentaires en dehors de la vue à fort grossissement. En haut à droite, images à faible grossissement d’images fluorescentes et Nomarski superposées (Sup). Barres d’échelle : 500, 50, 100, 20 μm respectivement.