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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Prélèvement de la moelle épinière
REMARQUE : Tous les instruments doivent être autoclavés (135 °C et 30 psi pendant 4 cycles de 7 minutes) pour la stérilité.
- Euthanasier des bébés souris C57BL/6 âgés de 1 à 3 jours dans une chambre contenant de l’isoflurane. Attendez 30 s après l’arrêt du mouvement et pincez la patte pour confirmer une absence de réponse.
- Séparez la tête du corps à l’aide de ciseaux, avec le chiot en position couchée.
- Stabilisez les pattes arrière ou la queue et les bras sur la table d’intervention, le côté dorsal faisant face à l’utilisateur.
- Coupez la peau à l’aide de ciseaux à iris incurvés.
- Coupez la moelle épinière de la région lombaire juste au-dessus des hanches et procédez à la coupe des deux côtés du thorax pour la séparer du corps.
note: Pour ce faire, il faut disséquer soigneusement la moelle épinière des organes viscéraux afin d’éviter d’endommager par inadvertance d’autres organes (figure 1a).
- Laver séquentiellement pendant 10 s dans des boîtes de Pétri de 3 x 10 cm contenant 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérilisée par filtre de 0,2 μm pour éliminer l’excès de tissu.
- Insérez une aiguille 22G et une seringue remplie de 5 ml de PBS stérilisé par filtre dans l’extrémité caudale de la colonne vertébrale et rincez le crâne, en laissant le cordon sortir dans une quatrième boîte de Pétri (figure 1b).
- Prélever la moelle épinière dans un tube de 15 mL avec 5 mL de HABG (tableau 1) sur de la glace. Faites attention à ne pas écraser la moelle épinière.
- Répétez les étapes 1.1 à 1.8 pour chaque chiot de la portée.
note: Idéalement, ce processus devrait prendre moins de 30 minutes par moelle épinière pour assurer une isolation saine des neurones.
2. Isoler les neurones
REMARQUE : L’étape suivante doit être effectuée dans une hotte à flux laminaire. Une familiarité avec la technique stérile de base est attendue.
- Hachage des mouchoirs
- Prenez le tube contenant la moelle épinière et secouez légèrement pour suspendre le tissu.
- Versez le tissu du tube dans une boîte de Pétri en verre de 60 mm et coupez-le en dés avec une lame de rasoir pour créer de fins morceaux de ~0,5 mm.
- Transférez le tissu à l’aide d’une pipette de gros calibre dans un tube de 15 mL contenant 5 mL de HABG.
- Placez-le dans un bain-marie à 30 °C pendant 30 min pour permettre aux cellules de s’équilibrer à cette température. Gardez les cellules sur un agitateur juste assez pour leur permettre d’être en suspension dans le fluide.
note: Cette étape est effectuée pour éviter de choquer les cellules lors du transfert de la glace au milieu de digestion. Maintenir les cellules à 30 °C aide à diminuer la mort cellulaire associée à un métabolisme autrement accru à 37 °C.
- Préparez le milieu de digestion (tableau 1).
- Préparez le gradient de densité (Tableau 1).
- Préparez chacune des 4 couches dans 4 tubes séparés de 15 ml, comme indiqué dans le tableau 1.
- Ajouter 1 ml de chaque couche dans un nouveau tube de 15 ml. Commencez par la couche 1 en bas et ajoutez-la séquentiellement jusqu’à ce que vous atteigniez la couche 4 en haut. Évitez de déranger les couches lors de l’ajout.
- Lavez les plaques revêtues de PDL. Lavez-les à l’eau stérile pendant quelques minutes avant de retirer l’eau restante et de les laisser sécher pendant 1 h.
- Transférez le tissu dans un milieu de digestion.
- Retirez le tube contenant du mouchoir du bain-marie à 30 °C et laissez-le reposer pendant quelques minutes.
- Retirez le tube du milieu de digestion du bain-marie à 37 °C et aspirez-le dans une seringue leur-lock.
- Aspirez l’excès de HABG du tube contenant du tissu.
- À l’aide d’un filtre leur-lock de 0,2 μm sur la seringue, ajoutez du milieu de digestion dans le tube contenant des tissus.
- Placez le tube dans un bain-marie à 30 °C pendant 30 min. Gardez les cellules en mouvement juste assez pour leur permettre d’être en suspension dans le fluide.
note: Il est important de ne pas garder les cellules dans le milieu de digestion trop longtemps ou de laisser la température devenir trop élevée, ce qui pourrait entraîner une digestion excessive et entraîner la suspension des tissus dans un mélange gélatineux.
- Pendant cette période, enduisez la laminine.
- Effectuer la trituration (c’est-à-dire séparer les cellules du tissu).
- Retirez le tube du bain-marie à 30 °C et laissez-le reposer pendant quelques minutes.
- Aspirez l’excès de milieu de digestion.
- Mettre le mouchoir en suspension dans 2 mL de HABG.
- À l’aide d’une pipette à alésage étroit, triturer 10x pour 45 s.
note: C’est probablement l’étape la plus cruciale et peut réduire considérablement le rendement si elle n’est pas faite correctement.
- Aspirez le tissu dans la pipette et videz immédiatement le contenu.
- Évitez d’introduire de l’air, car cela diminuerait considérablement le rendement viable.
note: La pipette idéale est une pipette en verre de 9 pouces. La pointe de la pipette doit être polie au feu pour lisser les surfaces rugueuses. Il doit ensuite être siliconé en le plaçant dans une solution 1:20 de dichlorodiméthylsilane (DMDCS) sous la forme et O/N gauche. La pipette doit ensuite être retirée et laissée sécher à l’air. Par la suite, il doit être autoclavé pour la stérilisation.
prudence: Le DMDCS et le chloroforme sont hautement inflammables, et la siliconation doit être effectuée dans une hotte.
- Aspirez les 2 premiers mL de surnageant et placez-les dans un nouveau tube de 15 mL étiqueté « collection ».
- Répétez les étapes 2.7.3 à 2.7.5 deux fois de plus (le tube de prélèvement de cellules doit contenir 6 ml à la fin).
- Transférez lentement le contenu du tube de collecte dans le tube de gradient préparé à l’étape 2.2, en évitant de perturber le gradient.
- À ce stade, sortez le milieu neurobasal précédemment préparé (tableau 1) du réfrigérateur et laissez-le se réchauffer dans un bain à 37 °C.
- Purifier les neurones.
- Centrifuger le tube gradient pendant 15 min à 800 x g et 22 °C.
- Prélever la ou les couches souhaitées à l’aide d’une pipette (figure 2) et les placer dans un nouveau tube de 15 ml. Pour l’isolement des neurones de la plus haute pureté (c’est-à-dire >90 %), collectez la couche 3. Pour plus de rendement avec moins de pureté (c’est-à-dire >70 à 80 %), récupérez les couches 2 et 3.
- Diluez le gradient de densité en ajoutant 5 mL de HABG aux couches nouvellement recueillies.
- Centrifugeuse à 200 x g pendant 2 min à 22 °C.
- Jetez le surnageant, mettez-le en suspension dans 5 ml de HABG et agitez la pastille pour suspendre les cellules.
- Centrifugeuse à 200 x g pendant 2 min à 22 °C.
- Jetez le surnageant, mettez-le en suspension dans 3 ml de milieu neurobasal et agissez la pastille pour remettre les cellules en suspension.
| média | stockage | Ingrédients | préparation |
| HABG | 4 °C/24h | | 100 mL | - Décongeler B27 dans un réfrigérateur à 4 °C O/N
- Stérilisation par filtre (0,22 μm) |
| Hibernation A | 97,8 mL |
| B27 [2 %] | 2 mL |
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0.25 mL |
| Milieux neurobasaux | 4 °C/1 semaine | | 100 mL | - Décongeler B27 dans un réfrigérateur à 4 °C O/N
- Stérilisation par filtre (0,22 μm)
- Aliquote 50 mL en tubes de 50 mL (conserver à 4 °C) |
| Neurobasale A | 97 mL |
| B27 [2 %] | 2 mL |
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0.25 mL |
| Stylo/streptocoque [1 %] | 1 mL |
| Milieu de digestion | Jour d’isolement | | 10 mL | - Agiter vigoureusement
- Laisser reposer dans un bain à 37°C pendant 30 min (idéalement préparé 30 min avant utilisation)
- Stérilisation par filtre (0,22 μm) |
| HA-CA | 10 mL |
| Papaïne | 25 mg |
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0.025 mL |
| Gradient de densité | Jour d’isolement | | 1 Dégradé | |
| Couche | OptiPrep | HABG |
| (0,13 ml) | (5,29 ml) |
| 1 Bas | 0,26 mL | 1,24 mL |
| deux | 0,19 mL | 1,31 mL |
| 3 | 0,15 mL | 1,35 mL |
| 4 Haut | 0,11 mL | 1,39 mL |
Tableau 1 : Préparation des milieux et solutions utilisés dans ce protocole.
