Production et purification d’anticorps recombinants à partir de cellules de mammifères

Résumé

Source : Shivange, Gururaj, et al. Analyse de la distribution tumorale et tissulaire de l’anticorps thérapeutique spécifique à l’antigène cible. J. Vis. Exp.(2020).

La vidéo explique le processus de production d’anticorps dans les cellules hôtes de mammifères, de l’expression des gènes à la sécrétion. Il implique la transcription, la traduction, la reconnaissance du signal, le repliement correct et la libération éventuelle dans le milieu extracellulaire via des vésicules sécrétoires.

Protocole

1. Expression et purification des anticorps

1. Maintenance des cellules CHO
   1. Cultivez des cellules CHO dans des milieux CHO FreeStyle complétés par un supplément de glutamine 1x disponible dans le commerce à 37 °C, en agitant à 130 tr/min avec 5 % de CO₂ à l’aide de longs flacons Erlenmeyer, en verre ou jetables.
      note: Il est fortement recommandé d’utiliser une fiole à chicanes avec un capuchon ventilé pour une agitation accrue et pour améliorer le transfert de gaz dans des conditions d’agitation. Une réduction significative du rendement en anticorps a été obtenue avec des flacons ordinaires (non cloisonnés) en raison de l’agitation limitée de la culture en suspension.
   2. Maintenir le nombre de cellules entre 1 et 5 x 10⁶ cellules/ml avec une viabilité cellulaire de >95 %. Si le nombre de cellules augmente au-delà de 5 x 10⁶ cellules/ml, divisez les cellules. Ne laissez jamais les cellules CHO atteindre moins de 0,2 x 10⁶ cellules/mL.
2. Transfection des cellules CHO
   1. Cultivez des cellules CHO dans 200 mL de milieu (2 x 10⁶ cellules/mL) dans des flacons à chicanes Erlenmeyer delong.
      note: Les cultures en suspension cultivées dans des flacons à chicanes ont toujours produit des rendements en protéines plus élevés que lorsqu’elles sont cultivées dans des flacons non cloisonnés.
   2. Dans un tube de 15 ml, prélever 5 ml de milieu CHO FreeStyle et ajouter 50 μg d’ADN de clone VH et 75 μg d’ADN de clone VL. Vortex pour bien mélanger.
   3. Incuber le mélange d’ADN à température ambiante pendant 5 min
      note: Une incubation plus longue réduit les rendements en protéines.
   4. Ajouter 750 μL de polyéthylèneimine (PEI) de 1 mg/mL à la solution d’ADN et agiter agressivement le mélange pendant 30 secondes. Incuber à température ambiante pendant 5 min
      supplémentaires note: L’Île-du-Prince-Édouard doit être fraîche. Le cycle de congélation-dégel multiple de l’Île-du-Prince-Édouard réduit considérablement le rendement global.
   5. Ajoutez tout le mélange d’ADN et de PEI dans les cellules tout en secouant manuellement la fiole. Incuber immédiatement les longs flacons à chicanes Erlenmeyer avec des cellules à 37 °C en agitant à 130 tr/min.
3. Expression
   REMARQUE : L’anticorps possède un peptide signal sécrétoire conçu à son extrémité N-terminale, ce qui aide les anticorps à être sécrétés dans le milieu.
   1. Cultivez les cellules transfectées à 37 °C, avec agitation à 130 tr/min le jour 1.
   2. Le jour 2, ajoutez 2 ml d’agent anti-agglomérant 100x et 2 ml de solution anti-anti-anti-mycosique 100x. Baisser la température (32-34 °C) et agiter à 130 tr/min.
   3. Tous les cinq jours, ajoutez 10 ml de tryptone N1 et 2 ml de supplément de glutamine 100x.
   4. Continuez à compter les cellules tous les trois jours à l’aide d’un hémocytomètre après avoir coloré une aliquote de cellules avec une coloration au bleu trypan. S’assurer que la viabilité cellulaire reste supérieure à 80 %.
   5. Le jour 10 ou 11, récoltez le milieu pour la purification des anticorps. Faites tourner la culture à 3000 x g, 4 °C pendant 40 à 60 min, puis filtrez le média transparent à l’aide de filtres à flacon de 0,22 μM.
4. Purification
   note: La purification des anticorps est effectuée à l’aide d’une colonne Protein-A disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux), à l’aide d’une pompe péristaltique.
   1. Équilibrer la colonne avec un volume de deux colonnes de tampon de liaison (20 mM de phosphate de sodium à pH 7,4).
   2. Passer le média filtré contenant l’anticorps (obtenu à l’étape 1.3.5) dans la colonne à un débit de 1 mL/min.
   3. Lavez la colonne avec un volume de deux colonnes de tampon de liaison.
   4. Éluer l’anticorps en fractions de 500 μL à l’aide d’un tampon d’élution de 5 mL (30 mM d’acétate de sodium à pH 3,4).
   5. Neutraliser le pH de l’anticorps élué en ajoutant 10 μL de tampon de neutralisation (3 M d’acétate de sodium à pH 9) par fraction.
      note: Les fractions nombres 3 à 6 contiennent la majeure partie de l’anticorps. Il est conseillé de conserver toutes les fractions au cas où l’anticorps serait élué dans une fraction plus tardive que prévu.
   6. Mesurez la concentration d’anticorps purifiés à l’aide d’un spectrophotomètre en sélectionnant le protocole par défaut pour les IgG. La concentration finale de l’anticorps est obtenue en mg/mL en tenant compte du poids moléculaire et du coefficient d’absorption.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
FreeStyle CHO média	Gibco Life Technologies	Réf. # 12651-014
Anti-Anti (100X)	Gibco Life Technologies	Réf. # 15240-062
Agent anti-grumeaux	Gibco Life Technologies	Cat # 01-0057DG
Seringue à insuline BD	BD BioSciences	Chat #329420
Étrier IVIS Spectrum	PerkinElmer	Chat #124262
CHO CD EfficientFeed B	Gibco Life Technologies	Cat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (milieu d'aigle modifié de Dulbecco)	Corning	Cat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640	Corning	Cat # 10-040-CV
IgG anti-humaines conjuguées Cy5 (H+L)	Jackson ImmunoResearch	Réf. # 709-175-149
GlutaMax-I (100X)	Gibco Life Technologies	Réf. # 35050-061
Kit HiPure Plasmid Maxiprep	Invitrogen	Réf. # K21007
Colonne HiTrap MabSelect SuRe	GE Soins de santé	Réf. # 11-0034-93
Isoflurane, USP	Convoitise	N° de catalogue : 11695-6777-2
Pommade oculaire lubrifiante	Actualiser Lacri-Lube	Chat #4089
Réactif de transfection PEI	Thermo Fisher	Chat # BMS1003A
Modèles expérimentaux : lignées cellulaires
Humain : OVCAR-3	Collection de la culture de type américain	ATCC HTB-161
Humain : cellules CHO-K	Stable transformé dans notre laboratoire	ATCC CCL-61
Souris : 4T1	Aimable don du Dr Chip Landen, UVA
Souris : MC38	Don aimable de Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC	Authentifié par profilage STR