Mesure de l’activation des fonctions effectrices médiées par Fc par les anticorps HA

Résumé

Source : Bailey, M. J., et al. Une méthode pour évaluer les fonctions effectrices médiées par Fc induites par les anticorps spécifiques à l’hémagglutinine de la grippe. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo présente un test mesurant l’activation des fonctions effectrices des lymphocytes T par les anticorps. L’ajout d’un anticorps monoclonal spécifique de l’hémagglutinine (HA) du virus de la grippe à des cellules de mammifères transfectées exprimant l’HA entraîne la formation de complexes immuns avec l’HA. Lors de l’introduction de lymphocytes T modifiés exprimant des récepteurs Fc et un rapporteur de luciférase, les lymphocytes T sont activés par les complexes anticorps-HA, et cette activation est détectée en ajoutant un substrat de luciférase et en mesurant la bioluminescence produite.

Protocole

1. Expression de l’hémagglutinine du virus de la grippe par transfection

1. Plaquez des cellules de rein embryonnaire humain (HEK 293T) à une densité de 2 x 10⁴ cellules/puits dans une plaque de 96 puits traitée par culture de tissus blancs et laissez-les reposer pendant 4 h dans un incubateur à 37 °C (avec 5 % de CO₂).
2. Cellules transfectives avec 100 ng d’ADN codant pour l’hémagglutinine virale et 0,2 μL de réactif de transfection par puits dans un volume total de 50 μL.
   note: Le plasmide et le réactif transfectant sont dilués dans 1x milieu sérique réduit en milieu sérique Opti-Minimum Essential Media (MEM).
3. Après avoir incubé les plaques dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 18 h, retirer le milieu de transfection.

2. Évaluation de l’activation de l’activité de la luciférase médiée par FcRg/NFAT par des anticorps monoclonaux ou des sérums

1. Tout d’abord, remplacer le milieu de croissance des cellules transfectées par 25 μL de milieu de test (1x RPMI 1640 complété par 4 % (vol/vol) de sérum fœtal fœtal à faible IgG).
2. Dans une plaque séparée à 96 puits, effectuer des dilutions quadruples des anticorps d’intérêt à partir de 30 μg/mL à l’aide du milieu de dosage. Effectuez des dilutions en triplicats, et un exemple de disposition de plaque est illustré à la figure 1A. Assurez-vous qu’un contrôle qui exclut les anticorps (aucun contrôle d’anticorps) et un contrôle de fond (tampon de test seul) sont inclus.
   note: Pour les témoins « sans anticorps » et les témoins de fond, ajoutez 25 μL de tampon de dosage à la place de l'anticorps.
3. Transférez 25 μL des anticorps dilués en série de l’étape 2.2 vers les puits correspondants sur la plaque de cellules transfectées.
4. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 °C (avec 5 % de CO₂) pendant 15 min.
5. Ajouter 25 μL de cellule Jurkat effectrice modifiée appropriée exprimant le FcgRIV murin ou le FcgRIIIa humain (75 000 cellules/puits). Le volume total de chaque puits doit être de 75 μL, et la concentration finale initiale de l’anticorps doit être de 10 μg/mL (figure 1B).
   note: Pour le contrôle de l’arrière-plan, ajoutez 25 μL de tampon de test au lieu de cellules effectrices. Pour examiner la phagocytose à médiation cellulaire dépendante des anticorps, une cellule Jurkat modifiée exprimant le FcgRIIa humain peut être utilisée.
6. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 6 h.
7. Décongeler et réchauffer le substrat de luciférase dans de l’eau à 37 °C pendant environ 1 h avant utilisation.
   note: Pour fabriquer le tampon de substrat de luciférase, reconstituez le substrat de dosage de la luciférase lyophilisée dans le tampon de dosage fourni. Le tampon de substrat reconstitué peut être stocké entre -30 °C et -10 °C jusqu’à six semaines.
8. Ajouter 75 μL/puits de tampon de substrat de luciférase à tous les puits, à l’exception du contrôle de fond.
9. Lire sur un luminomètre.
10. Calculez l’induction de pliage à l’aide de l’équation suivante : Induction de pliage = (Valeur induite-Valeur de fond) / (Pas de valeur mAb-Valeur de fond).

Résultats

Figure 1 : Schéma de la disposition d’une plaque d’échantillon et de la composition des groupes expérimentaux. (A) La concentration initiale de chaque échantillon d’anticorps est de 10 μg/mL et diluée en série sur la plaque (colonne 1 à colonne 12) 4 fois. Chaque échantillon est réalisé en trois exemplaires. La rangée G est réservée au contrôle sans mAb, et la rangée H est l’a...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cellules HEK 293T	ATCC	CRL-3216	Cellules rénales embryonnaires humaines
Lipofectamine 2000	Technologies de la vie	11668019	Réactif de transfection
1X Opti-MEM Sérum Réduit Medium	ThermoFisher Scientific	Référence 51985-034
Plaque de 96 puits traitée pour culture de tissus blancs	Corning, Inc.	Référence 3917	Plaques de dosage
10X MEM	Gibco	Référence 11430-030
Cellule Jurkat exprimant le FcgRIV murin	Promega	M1201	Le kit comprend des cellules, un système de dosage Bio-Glo Luciferase, un sérum 1X RPMI et un sérum à faible IgG
Cellule Jurkat exprimant le FcgRIIIa humain	Promega	G7010	Le kit comprend des cellules, un système de dosage Bio-Glo Luciferase, un sérum 1X RPMI et un sérum à faible IgG
Cellule Jurkat exprimant le FcgRIIa humain	Promega	Référence G9901	Le kit comprend des cellules, un système de dosage Bio-Glo Luciferase, un sérum 1X RPMI et un sérum à faible IgG
Luminomètre	BioTek	Lecteur multimode Synergy H1	Lecteur de plaques à luminescence
Système de dosage de la luciférase Bio-Glo	Promega	G7940	Contient un tampon de dosage de la luciférase et un substrat de dosage de la luciférase