Génération de variants d’échappement du virus de la grippe contre les anticorps neutralisants

REMARQUE : Les anticorps spécifiques à l’HA qui inhibent la réplication virale peuvent généralement être classés en deux catégories : i) ceux qui se lient sur ou à proximité du site de liaison au récepteur au-dessus de la tête globulaire et ii) ceux qui se lient distal du domaine de liaison au récepteur, ce qui comprend le côté latéral de la tête globulaire et la région de la tige de l’HA. Les anticorps qui ciblent le site de liaison du récepteur empêchent l’engagement de motifs d’acide sialique à la surface des cellules cibles et peuvent être mesurés à l’aide d’un test d’inhibition de l’hémagglutination (HI). Les anticorps HI-négatifs, tels que les anticorps spécifiques de la tige, peuvent toujours inhiber la réplication virale, mais ne peuvent être évalués qu’à l’aide de tests de neutralisation.

1. Catégorisation des anticorps en fonction des activités IH

1. Dosage HI
   1. Dans une plaque à fond en V de 96 puits, ajoutez 25 μL de 1x PBS sur les colonnes 2 à 12.
   2. Diluer l’anticorps monoclonal (mAb) 7B2 (spécifique de la tête), 6F12 (spécifique de la tige) et un isotype témoin à 100 μg/mL dans 1x PBS et aliquote 50 μL des préparations d’anticorps dilués dans la colonne 1. Incluez également un témoin sans mAb en ajoutant 50 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (figure 1A).
   3. Effectuez des dilutions en série 2 fois des anticorps en transférant 25 μL de la colonne 1 à la colonne 2, et ainsi de suite. Jetez les derniers 25 μL de la colonne 12 (Figure 1A).
      note: Assurez-vous d’inclure une ligne sans contrôle d’anticorps.
   4. Diluer le stock de virus (un virus réassorti exprimant l’hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA) de A/California/04/09 avec les segments internes de A/Puerto Rico/8/34) à 8 unités d’hémagglutination/25 μL de stock de virus dilué. Ajouter 25 μL de la substance virale diluée (8 unités d’hémagglutination) dans chaque puits (rangées A à G).
      note: Le mélange d’anticorps et de virus doit avoir un volume final de 50 μL avec une concentration finale initiale de 50 μg/mL.
   5. Incuber la plaque à température ambiante (RT) pendant 45 min.
   6. Pour la rangée de titrage arrière (H), ajoutez 50 μL de 1x PBS sur les puits H2 à H12. Ajouter 100 μL des 8 unités d’hémagglutination/25 μL dans le puits H1. Diluer en série deux fois en transférant 50 μL de H1 à H2, et ainsi de suite. Jeter les derniers 50 μL du puits H12. Enfin, ajoutez 50 μL de globules rouges de poulet (GR) à 0,5 % dans tous les puits de la plaque à fond en V à 96 puits.
      note: Les échantillons d’anticorps monoclonaux de l’essai doivent avoir un volume final de 100 μL : anticorps monoclonaux (25 μL), virus (25 μL) et globules rouges (50 μL). Le volume final du témoin sans anticorps monoclonaux doit contenir 25 μL de 1x PBS, 25 μL de virus et 50 μL de globules rouges.
   7. Incuber la plaque à 4 °C pendant 1 h.
   8. Lisez visuellement les plaques pour l’activité HI. S’il y a une lecture positive pour un anticorps particulier, passez à l’étape 2.1 pour générer des variants d’échappement. Si l’anticorps est négatif pour les HI, passez à l’étape 1.2 ci-dessous pour évaluer si l’anticorps a une activité neutralisante dans un test de culture cellulaire.
      note: Une lecture positive d’un anticorps monoclonal HI-actif est indiquée par une pastille de globule rouge foncé au centre d’un puits (figure 1B ; 7B2) qui formera une goutte d’eau lorsque la plaque inférieure en V de 96 puits est maintenue à un angle de 45°. Une lecture négative ne formera pas de pastille de globule rouge foncé dans le puits (figure 1B ; 6F12 et pas d’anticorps monoclonaux). De plus, le témoin isotype ne formera pas de pastille de globule rouge foncé et devrait être identique à l’anticorps spécifique de la tige, 6F12 ou à l’échantillon témoin sans anticorps monoclonal (figure 1B).

2. Génération de variants mutants d’échappement

REMARQUE : Les anticorps neutralisants qui ont ou non une activité HI sont analysés plus en détail avec les protocoles spécifiques décrits ci-dessous.

1. Protocole 1 : Anticorps HI-positifs/Neutralisation positive (Figure 2A)
   1. Préparez un stock de virus de 10⁶ unités formant des plaques/millilitre (PFU/mL) dans 1x PBS dans un volume de 400 μL.
   2. Préparer quatre dilutions de l’anticorps d’intérêt à des concentrations croissantes (p. ex., 0, 0,5, 0,05 et 0,005 mg/mL) dans 1x PBS dans un volume de 100 μL par dilution.
      REMARQUE : Le virus de type sauvage doit toujours être transmis en parallèle et en l’absence d’anticorps. Les séquences de ces virus passés aideront à distinguer l’adaptation aux conditions de culture cellulaire et les mutations d’échappement.
   3. Mélanger 100 μL de 10⁶ PFU/mL de virus avec 100 μL de chaque dilution d’anticorps ou 100 μL de 1x PBS.
   4. Incuber 1 h dans un incubateur à 37 °C (avec 5 % de CO₂). Vortex brièvement. Injecter 200 μL de chaque mélange dans des œufs de poule embryonnés exempts d’agents pathogènes spécifiques (FPS).
   5. Incuber les œufs à 37 °C (sans CO₂) pendant 40-44 h.
   6. Sacrifiez les œufs embryonnés infectés par le virus en l’incubant à 4 °C pendant au moins 6 h.
   7. Récoltez le liquide allantoïdien des œufs, comme décrit précédemment.
   8. Effectuez le test d’hémagglutination, comme décrit ci-dessus. Si toutes les préparations de liquide allantoïdien n’ont pas de titres d’hémagglutination, répéter à partir de l’étape 2 avec des dilutions d’anticorps allant de 0,005 mg/mL à 0,00005 mg/mL.
      note: Une concentration saturante d’un anticorps HI positif peut neutraliser toutes les particules virales présentes. Par conséquent, il peut être nécessaire de diminuer la quantité d’anticorps présents dans le passage.
   9. Confirmez les variantes d’échappement en effectuant le test HI (étape 1.1).
      note: Les anticorps HI-actifs bloquent l’engagement de l’acide sialique par HA sur les cellules cibles. Par conséquent, un virus en présence de son anticorps apparenté perd la capacité d’agglutiner les globules rouges (présence de pastilles de globules rouges). Théoriquement, les variants d’échappement des anticorps HI-actifs peuvent toujours se lier aux motifs de l’acide sialique même en présence de son anticorps apparenté et peuvent donc agglutiner les globules rouges (pas de pastille de globules rouges). Si l’IH de l’anticorps d’intérêt est toujours détectable, répétez le protocole de l’étape 2.1.2 avec une concentration initiale plus élevée de l’anticorps.

Figure 1 : Dosage HI. (A) un schéma pour la mise en place d’un test IH afin de tester l’activité de deux mAbs spécifiques H1 de souris 7B2 (spécifique à la tête) et 6F12 (spécifique à la tige) à l’aide d’une plaque à fond en V de 96 puits, et (B) un exemple des résultats d’un test HI

Figure 2 : Génération de mutants d’échappement. La méthodologie suggérée dépendra de l’IH et de l’activité de microneutralisation présentée par l’anticorps. La génération de mutants d’échappement contre (A) les anticorps neutralisants HI-positifs peut nécessiter un seul passage dans les œufs, tandis que (B) les anticorps neutralisants HI-négatifs peut impliquer plusieurs passages avec des quantités croissantes d’anticorps dans la culture de tissus cellulaires.