Génération d’anticorps monoclonaux recombinants à partir de cultures de cellules de mammifères

Résumé

Source : Nogales-Gadea, G. et al., Génération d’anticorps monoclonaux IgG humains recombinants à partir de lymphocytes B triés immortalisés.J. Vis. Exp.(2015)

Cette vidéo présente une méthode de génération d’anticorps à partir de cellules de mammifères en introduisant des vecteurs plasmidiques avec des gènes à chaîne lourde et légère. Ces vecteurs interagissent avec la polyéthylénimine et pénètrent dans les cellules en formant des polyplexes ; Plus tard, ils sont traduits en protéines individuelles et assemblés en anticorps complets, qui sont sécrétés dans le milieu extracellulaire.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC)

1. Centrifuger 25 ml du sang hépariné des participants à 900 x g pendant 15 min, dès que possible après l'extraction du sang. S’il y a moins de sang, réduisez les réactifs en conséquence. Effectuez toutes les étapes suivantes dans une hotte.
2. Transférez le sérum dans un tube propre. Il peut être utilisé dans des étapes ultérieures pour la congélation des PBMC ou, dans le cas de patients auto-immuns, pour tester des auto-anticorps.
3. Diluez le sang avec 10 ml de milieu 1640 du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) et remettez les cellules en suspension en pipetant de haut en bas.
4. Ajouter 15 ml d’une solution contenant du polysaccharose et du diatrizoate de sodium (1,077 g/ml) dans un nouveau tube de 50 ml.
5. Appliquez doucement le sang sur la solution à l’étape 1.4 en rapprochant les deux ouvertures des tubes jusqu’à ce que les deux liquides entrent très lentement en contact, puis décantez lentement la suspension PBMC sur le tube de 50 ml. Cette étape est essentielle pour avoir une bonne séparation des PBMC.
6. Centrifuger le tube obtenu à l’étape 1.5 à 400 x g sans frein à température ambiante (RT) pendant 20 min.
7. Après la centrifugation, récupérez avec la pipette l’anneau blanc qui apparaît dans la partie centrale du tube, qui contient les PBMC.
8. Lavez les cellules avec 25 ml de média RPMI 1640.
9. Centrifugeuse 300 x g à RT pendant 10 min.
10. Jetez le surnageant et lavez les cellules avec 10 ml de RPMI 1640. Centrifugez à nouveau comme à l’étape 1.9.
11. Comptez les PBMC avec une chambre Neubauer comme indiqué précédemment.
12. Traiter les PBMC comme indiqué à la section 2 ou les stocker pour une utilisation ultérieure comme suit : 10 millions de PBMC pour congélation par tube cryovial dilué dans 1 ml de diméthylsulfoxyde à 10 % (DMSO) et à 90 % de sérum obtenu à l’étape 1.2. Congeler progressivement et pour un stockage prolongé dans de l’azote liquide.

2. Coloration des PBMC pour le tri des CD22+ et de l’immunoglobuline G (IgG+) par cytométrie cellulaire

1. Placez les PBMC dans une fiole de culture cellulaire de^{25 cm contenant} 6 ml de milieu RPMI 1640 complet (complété par de la L-glutamine, 10 mM de tampon d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanasilfonique (HEPES), 50 U/ml de pénicilline, 50 μg/ml de streptomycine et 10 % de sérum de bovin fœtal) et laissez-les récupérer O/N dans l’incubateur à 37 °C à 5 % de dioxyde de carbone (CO₂).
2. Bloquez les tubes stériles de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) avec une solution saline tamponnée au phosphate d’albumine (PBS) stérile à 4 % pendant la nuit (H/N). Lavez les tubes deux fois avec du PBS et remplissez-les de 500 μl de milieu RPMI 1640 complet. Utilisez ces tubes pour récupérer les cellules après le tri.
3. Recueillir les PBMC dans un tube et centrifuger à 400 x g à RT pendant 5 min.
4. Suspendez à nouveau les cellules dans la mémoire tampon d’étiquetage (voir étapes 2.5 et 2.6) et comptez-les. Le tampon de marquage est constitué de sérum de veau fœtal stérile à 2 % et de 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans du PBS.
5. Préparez 3 tubes FACS de 10^{à 5} cellules chacun et mettez-les en suspension dans 100 μl de tampon de marquage. Ces tubes serviront à définir les portes du tri.
   1. Dans le premier tube, ajoutez 5 μl d'anticorps anti CD22 PerCP (recommandé dans la fiche technique du fabricant), dans le deuxième tube 20 μl d'anticorps anti IgG PE (recommandé dans la fiche technique du fabricant), et rien dans le troisième tube. Incuber sur glace et dans l’obscurité pendant 30 min.
6. Réintroduisez 5 millions de cellules dans 200 μl de tampon de marquage dans un tube FACS et ajoutez 10 μl d’anti-CD22 PerCP et 40 μl d’anti-IgG PE. Incuber les cellules sur glace et à l’obscurité pendant 30 min. Si le tri d’un plus grand nombre de cellules est souhaité, augmentez l’échelle de tous les réactifs.
7. Cellules de centrifugation à 400 x g avec frein bas pendant 5 min à RT.
8. Décantez doucement le surnageant.
9. Remettre les cellules en suspension dans 500 μl de tampon de marquage. Cellules de centrifugation à 400 x g avec frein bas pendant 5 min à RT. Répéter les étapes 2.7 et 2.8
10. Décantez doucement le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 300 μl de milieu complet RPMI.
11. Passez les cellules à travers un filtre de 0,45 μm. Les cellules sont prêtes à être triées.

3. Tri des lymphocytes B CD22+ et IgG+

1. Utilisez 3 tubes de contrôle pour établir la viabilité des cellules. Dans le témoin sans coloration, utilisez le diagramme de dispersion vers l’avant et la taille pour définir le déclenchement des lymphocytes. Les contrôles avec le CD22 PerCP et l’anti-IgG PE servent à établir les portes et la porte de tri. Effectuez les données précédemment renseignées.
   REMARQUE : Une porte est un ensemble de limites de valeurs (limites) qui servent à isoler un groupe spécifique d’événements cytométriques, dans notre cas des cellules, à partir d’un grand ensemble. Dans le cas d’une porte de tri, les limites de valeur permettent de récupérer les événements cytométriques, les cellules, qui se trouvent à l’intérieur des limites définies : CD22+ et IgG+.
2. En tant que tube de collecte dans le tri, utilisez les tubes bouchés avec 500 μl de milieu RPMI 1640 complet, obtenus à partir de l’étape 2.2.
3. Procédez au tri des doubles positifs : CD22+ IgG+. NOTEZ le nombre final de cellules dans chaque condition. Placez les cellules triées sur le dessus des cellules d’alimentation dès que possible.

4. Irradiation des cellules nourricières

REMARQUE : Effectuez la préparation des cellules d’alimentation entre 1 et 3 jours avant le tri. Au moins 5 000 cellules wi38 sont nécessaires par puits dans une plaque de 96 puits ronds. Effectuez les étapes 4.1, 4.2 et 4.4 dans une hotte.

1. Cultivez les cellules wi38 à 37 °C et 5 % de CO₂ dans un milieu RPMI 1640 complet (comme pour les PBMC) jusqu’à ce que le nombre de cellules souhaité soit atteint.
2. Irradiez-les à 50 Gris, en suivant un protocole décrit ci-dessus. Effectuer l’irradiation une fois que les cellules wi38 ont été trypsinisées et remises en suspension dans un milieu RPMI complet, ou avec wi38 attaché au ballon de culture et trypsinisé après l’irradiation. Suivre la méthode de trypsinisation indiquée par le fournisseur de cellules wi38. Irradier le nombre de cellules nécessaires pour couvrir les puits nécessaires au placage des cellules B IgG+ (1 % du PBMC total compté à l’étape 1.11).
3. Plaque de 90 μl contenant 5 000 cellules wi38 irradiées dans chaque puits de la plaque à 96 puits ronds. Laissez les puits de la rangée extérieure de la plaque vides (car ils s’évaporent plus rapidement) et n’utilisez que les 60 puits au milieu de la plaque pour le placage des cellules. Remplissez les puits extérieurs qui encadrent la plaque avec 200 μl de PBS.
4. Placez-les dans un incubateur à 37 °C à 5 % de CO₂, jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

5. Placage Infection par le virus d’Epstein-Barr (EBV) et croissance

1. Diluer les PBMC triés, pour plaquer 50 cellules dans 50 μl de milieu complet RPMI 1640 par puits dans la plaque à 96 puits ronds (préalablement plaquée avec des cellules irradiées wi38). Effectuez des pas dans une hotte équipée pour le travail EBV.
   REMARQUE : l’infection de 50 cellules par puits est optimisée et augmente la probabilité de produire un anticorps monoclonal, cependant, il est recommandé de le vérifier par réaction en chaîne par polymérase (PCR) comme décrit précédemment.
2. Ajouter 60 μl de surnageant EBV (contenant 3 à 4 x 10⁸ copies virales/ml) dans chaque puits de la plaque à 96 puits ronds. PRÉCAUTIONS À prendre pendant les travaux sur l’EBV.
3. Ajouter 1 μg/ml de CpG (ODN2006) par puits.
4. Laissez les cellules dans un incubateur à 37 °C à 5 % de CO₂.
5. Surveiller visuellement la croissance des clones au microscope après une semaine.
   REMARQUE : Quelques exemples de croissance des lymphocytes B peuvent être vus ci-dessous dans la section des résultats. Notez que les taux de croissance des clones peuvent varier et qu’un temps supplémentaire peut être nécessaire pour commencer à voir une certaine masse cellulaire se développer au milieu du puits.
6. Après les deux^premières semaines, on surveille la croissance du clone au microscope optique et on procède au premier échange de milieu. Pipetez lentement 90 μl de fluide à partir de la partie supérieure du puits et recueillez-le dans une plaque propre de 96 puits. (Les lymphocytes B se trouvent au fond du puits, il n’y a donc aucun risque de les aspirer).
   1. Ajouter à chaque puits 100 μl de milieu RPMI 1640 complet complété par 1 μg/ml de CpG (ODN2006) et 50 U/ml d’IL2. Si des clones sont en croissance, analysez ce premier échange de milieux par immuno-sorbant enzymatique (ELISA) comme à l’étape 6.
7. Surveillez la croissance des clones et changez de milieu après la 3^e et la 4^e semaine de croissance en prenant 90 μl de milieu et en ajoutant 100 μl de milieu RPMI 1640 complet complété par 1 μg/ml de CpG (ODN2006) et 50 U/ml d’IL2. Utilisez le surnageant collecté pour surveiller la production d’IgG par ELISA, comme à l’étape 6.
   REMARQUE : Après un mois, la croissance du clone devrait être évidente en observant les agrégats de cellules rondes qui se trouvent généralement au milieu du puits à fond rond.
8. À cette étape, changez de support de la même manière que les semaines précédentes, mais uniquement avec un support RPMI 1640 complet. Un bon indicateur pour connaître le bon moment pour changer de média est la couleur du média, s’il devient jaunâtre, les cellules ont besoin d’un échange de média.
9. Lorsque les plaques de 96 puits contiennent de gros clones (environ 5 x 10⁵ cellules), transférez-les dans un puits plat d’une plaque de 24 puits. Ajoutez 300 μl de média RPMI 1640 complet dans le nouveau puits. Remettez en suspension le clone en croissance de 96 puits, en pipetant plusieurs fois de haut en bas, et transférez les cellules dans le nouveau puits, en les distribuant de manière homogène. Ajoutez de nouveaux médias si nécessaire.
   1. Lorsque les puits de la plaque de 24 puits sont remplis de cellules (environ 5 x 10⁶ cellules), transférez-les dans un puits plat d’une plaque de 6 puits. Ajoutez 2 ml de média RPMI 1640 complet dans le nouveau puits. Remettez les cellules en suspension dans la plaque à 24 puits en pipetant plusieurs fois de haut en bas, et répartissez-les de manière homogène dans le nouveau puits.
10. Ajoutez des médias si nécessaire. Si les cellules ne doivent pas être maintenues en culture, granulez les cellules à 400 x g pendant 5 min à RT. Stockez les surnageants pour le test ELISA. Lavez une fois la pastille de cellules avec 1 x PBS, centrifugez-la à nouveau à 400 x g pendant 5 minutes et conservez-la au sec à -80 °C jusqu’à l’extraction de l’ARN.
    1. Lorsque les cellules de la plaque à 6 puits deviennent confluentes (environ 20 x 10⁶ cellules), transférez-les sur une plaque de culture de 60 mm. Ajoutez 4 ml de support RPMI 1640 complet dans la nouvelle plaque. Remettez les cellules en suspension dans une plaque à 6 puits et transférez-les comme indiqué aux étapes 5.9 et 5.10.
11. Ajoutez de nouveaux médias si nécessaire. À cette étape, congelez les cellules à 10 à 30 millions/ml dans 90 % de sérum de veau fœtal et 10 % de DMSO. Si vous souhaitez de plus grandes quantités de cellules, continuez l’expansion des clones dans des plaques de surface plus grandes.

6. ELISA pour la détection des anticorps IgG

1. Distribuer 50 μl/puits dans une plaque ELISA d’anticorps Fc anti-humain F(ab)₂ de chèvre dilué 1 200 dans un tampon d’enrobage. Le tampon d’enrobage contient 50 mM de carbonate de sodium (Na₂, CO₃), pH 9,6.
2. Scellez les plaques avec un autocollant en plastique et incubez 1 h à 37 °C. Sinon, incubez à 4 °C O/N.
3. Lavez chaque puits 6 fois avec 200 μl de tampon de lavage. Le tampon de lavage contient 0,05 % de Tween-20 dans 1 x PBS. Ne touchez pas et ne rayez pas la surface du puits où l’anticorps s’est lié.
4. Bloc avec tampon de blocage, 100 μl/puits. Le tampon bloquant contient 4 % de lait écrémé en poudre dans le PBS. Fermez la plaque et incubez 1 h à 37 °C.
5. Ne pas laver. Jetez le tampon de blocage et frappez l’assiette 3 fois à l’envers sur une serviette en papier pour éliminer le liquide résiduel.
6. Incuber les surnageants et les étalons des clones.
   1. Pour un premier essai, diluer les surnageants clones obtenus à l’étape 5.6 ou 5.7 1/3 dans RPMI. Pour les étalons, diluer avec une solution moyenne d’IgG humaines RPMI pour obtenir : 1 000 ng/ml, 500 ng/ml, 250 ng/ml, 125 ng/ml, 62,5 ng/ml, 31,25 ng/ml, 15,6 ng/ml et blanc. Utiliser 50 μl/puits et incuber à 37 °C pendant 60 min. Analysez d'autres dilutions du surnageant du clone pour tester l'affinité de l'anticorps, par exemple 1/10 ou 1/100.
7. Laver comme fait à l’étape 6.3.
8. Utiliser 50 μl/puits d’IgG Fc peroxydase humaine conjuguée 1:20 000 dans le tampon d’incubation. Le tampon d’incubation contient 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 0,02 % de Tween 20 dans 1x PBS. Incuber à 37 °C pendant 60 min.
9. Laver comme fait à l’étape 6.3.
10. Ajouter une solution de substrat de 100 μl/puits contenant 0,1 % de 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB). Incuber 10 min jusqu’à ce qu’une couleur bleue stable se forme dans les puits. Fais attention; N’attendez pas trop longtemps !
11. Arrêtez la réaction en ajoutant 50 μl d’acide sulfurique 2 M (H₂SO₄). Mesurer l’absorption à 450 nm, dans les 30 minutes suivant l’arrêt de la réaction.
    REMARQUE : Tous les surnageants des clones avec 3 écarts-types au-dessus du blanc seront considérés comme positifs pour les anticorps humains IgG. Pour confirmer l’existence de clones positifs, cet ELISA doit être répété au moins trois fois dans différents surnageants du même clone. De plus, il est recommandé d’écarter la possibilité d’une réactivité croisée non spécifique afin de s’assurer qu’il n’y a pas de signal lorsque les surnageants sont incubés dans des puits non enrobés mais bloqués. À cette étape, un test de détection pour dépister la spécificité antigénique des anticorps d’intérêt peut être effectué avant de passer à la section 7.

7. Isolement de l’ARN et synthèse de l’ADN complémentaire du premier brin (ADNc) des clones IgG producteurs

1. Dès que la production d’IgG est confirmée par ELISA, extrayez l’ARN du clone.
2. Pour extraire l’ARN des cellules en croissance aux étapes 5.7 ou 5.9, utilisez le kit de synthèse directe d’ADNc des cellules en exposant III, qui permet d’obtenir de l’ADN de 10 000 cellules pour une cellule.
3. Pour extraire l’ARN de plus grandes quantités de cellules ou de la pastille stockée à l’étape 5.11, utilisez le kit d’isolement d’ARN hautement pur. D’autres systèmes d’extraction d’ARN peuvent également convenir à cette étape. Suivez les instructions du fabricant.
4. Pour les numéros de cellule compris entre 1 x 10⁶ et 1 x 10⁴, utilisez le système de transcription inverse, en suivant les instructions du fabricant. D’autres systèmes de synthèse de l’ADNc du premier brin peuvent également être utilisés.

8. 1^ère et 2^ème PCR pour l’amplification des chaînes lourdes et légères des clones de cellules B productrices d’IgG

1. Avec l’ADNc des clones cellulaires, obtenu aux étapes 5.6 et 5.7 et positif à l’ELISA IgG à l’étape 6, effectuez une PCR avec les amorces énumérées dans le tableau 1.
2. Mettez en place des PCR indépendantes pour chaque chaîne IgG lourde, kappa et lambda. Préparez une solution mère avec des amorces avant et arrière à des concentrations égales. Ajoutez-les à la réaction à une concentration finale de 0,4 μM.
3. Utilisez 1 μl de synthèse de l’ADNc pour effectuer la PCR 1^ST. Ici, effectuez des réactions de 20 μl en suivant les instructions du fabricant de Takara Taq. Alternativement, utilisez d’autres polymérases.
4. Placez la 1ère PCR dans les conditions de cycle suivantes : 94 °C pendant 5 min ; (50 cycles de : 94 °C pendant 30 secondes ; 58 °C pendant 30 secondes et 72 °C pendant 45 secondes ; 72 °C pendant 7 minutes ; laisser refroidir à 4 °C. Inclure un blanc dans la réaction, pour détecter d’éventuelles contaminations.
5. Préparez 1 TBE (89 mM de trisborate et 2 mM d’EDTA). Dans un volume de 100 ml de 1x TBE, ajoutez 1 g d’agarose (gel d’agarose à 1 %). Faites chauffer la solution au micro-ondes pendant environ 1 min, jusqu’à ce que l’agarose soit dissoute. Ajoutez ensuite 4 μl de bromure d’éthidium à 10 mg/ml (ou un colorant d’ADN équivalent) et mélangez.
   1. Versez le contenu dans un plateau et attendez qu’il soit polymérisé. Exécutez 5 μl du mélange PCR dans le gel pour visualiser les bandes. Les fragments de chaîne lourds doivent être d’environ 400 à 550 pb, tandis que les chaînes légères doivent être d’environ 300 à 400 pb. Si les bandes ne sont pas détectées, procédez de même à la 2^ème PCR.
6. Utilisez 1 μl du premier mélange PCR pour effectuer la 2e PCR. Utilisez les mêmes réactifs qu’à l’étape 8.2, mais en utilisant le mélange approprié d’amorces (voir tableau 1). Pour la 2ème^PCR, utilisez les conditions suivantes : 94 °C pendant 5 min ; (50 cycles de : 94 °C pendant 30 secondes ; 56,5 °C pendant 30 secondes et 72 °C pendant 55 secondes) ; 72 °C pendant 7 min ; laisser refroidir à 4 °C. Inclure un blanc dans la réaction, pour détecter d’éventuelles contaminations par PCR.
7. Préparez un gel d’agarose comme décrit au point 8.5. Exécutez le gel pour visualiser le produit PCR comme à l’étape 8.5.1 Utilisez les amplifications qui contiennent des fragments de la bonne taille pour le clonage à l’étape 9 et produisez les anticorps à l’étape 10.
8. Séquencez l’ADN à l’aide d’une réaction de 10 μl contenant : 100 ng de la 2^e PCR, 0,2 μM de l’amorce ou du mélange d’amorces, 1 μl de la terminaison et 1 μl du tampon. Effectuez la réaction de séquençage dans les conditions suivantes : (25 cycles de : 96 °C pendant 10 secondes ; 50 °C pendant 5 secondes ; et à 60 °C pendant 4 minutes) ; 60 °C pendant 7 min ; laisser refroidir à 4 °C.
9. Purifiez les réactions de séquençage avec des colonnes de microspin G50 en suivant les instructions du fabricant. Évaluez les séquences de la ligature dans un analyseur de séquence automatique comme décrit précédemment. Les électrophérogrammes doivent être propres et correspondre à une seule séquence d’immunoglobulines.
   REMARQUE : Si les produits PCR présentent des séquences d’immunoglobulines peu claires ou mélangées, veuillez envisager de les cloner à l’aide du système TopoTA, afin d’obtenir des séquences isolées, puis de passer à l’étape 9.

9. Clonage et séquençage des chaînes lourdes et légères des clones IgG producteurs

1. Préparez 1 μg d’ADN des vecteurs pFUSE2ss-CLIg-hk, pFUSE2ss-CLIg-hl2 et pFUSEss-CHIg-hG1.
2. Digérez ces vecteurs avec les enzymes de restriction appropriées. Utilisez EcoRI et BsiWI pour pFUSE2ss-CLIg-hk, EcoRI et AvrII pour pFUSE2ss-CLIg-hl2, et EcoRI et NheI pour pFUSEss-CHIg-hG1. Utilisez 3 unités de chaque enzyme de restriction pour 1 μg d’ADN du vecteur.
   1. Digérer avec une enzyme et purifier le produit digéré avec un kit de purification PCR. Digérer avec la deuxième enzyme et purifier avec un kit d'extraction de gel (selon le protocole du fabricant). Coupez le fragment d’intérêt dans le gel d’agarose. Préparez le gel d’agarose comme à l’étape 8.5.
3. Digérer les 2^èmes produits PCR du clone IgG producteur : EcoRI et BsiWI pour l’amplification en chaîne kappa, EcoRI et AvrII pour l’amplification en chaîne lambda, et EcoRI et Nhe I pour l’amplificationen chaîne lourde. Digérer avec une enzyme et purifier le produit digéré avec un kit de purification PCR. Digérer avec la deuxième enzyme et purifier le produit digéré avec un kit de purification PCR. Utilisez les mêmes unités d’enzymes et la même quantité d’ADN qu’à l’étape 9.2.
4. Lister les fragments de PCR à l'intérieur des vecteurs avec de l'ADN ligase T4 16 °C O/N en suivant les recommandations du fabricant. Le rapport utilisé doit être de 1 : 2 (vecteur : insertion).
5. Utilisez 1 μl de ligature pour transformer les bactéries DH5α. Suivre les conditions du fabricant DH5α pour la transformation. Propager les bactéries dans les plaques de blasticidine ou de zéocine, selon le type de vecteur utilisé. Incuber les plaques O/N à 37 °C.
6. Cultivez des colonies individuelles et extrayez l'ADN avec un kit miniprep, en suivant les instructions du fabricant. À utiliser pour la croissance d'une colonie unique et l'extraction de l'ADN selon les recommandations du fabricant du kit de minipréparation de l'ADN. Analysez-les par digestion avec les enzymes utilisées pour la préparation des vecteurs et des inserts comme aux étapes 9.2 et 9.3.
7. Séquencez l’ADN en utilisant 100 ng du vecteur, comme indiqué aux étapes 8.8 et 8.9.

10. Production d’anticorps dans les cellules HEK

1. Cultivez des cellules HEK dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % de L-glucose, 1 % de pénicilline/streptavidine (DMEM+) jusqu'à une confluence de 75 % dans une plaque de culture cellulaire de 150 mm. Effectuez dans un capot les étapes 10.1 à 10.7.
2. Avant la transfection, changez le milieu par le milieu comme précédemment, mais sans sérum de veau fœtal.
3. Pour chaque transfection à chaîne légère lourde, préparer un mélange de transfection avec 2,5 ml de DMEM (sans sérum), 9 g du vecteur à chaîne lourde, 6 g du vecteur à chaîne légère et 100 g de solution de polyéthylénimine (PEI) (à partir d’une matrice de 1 g/μl). Incuber à RT pendant 15 min.
4. Ajoutez délicatement 2,5 ml du mélange de transfection préparé à l’étape 10.3 dans les cellules HEK de la plaque. Basculez l’assiette pour répartir uniformément.
5. Incuber les cellules dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 24 heures.
6. Changez le milieu de culture en milieu sans sérum de veau fœtal.
7. Récupérez le support des assiettes 4 jours plus tard.
   REMARQUE : Les anticorps présents dans les milieux peuvent être utilisés pour caractériser leur réactivité in vitro et in vivo.

Table 1. Apprêts utilisés.

1amorces PCR
	Vers l'avant (5'-3')	Marche arrière (3'-5')
IgG	5′ L-VH 1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG	3′ Cγ CH1 GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC
	5′ L-VH 3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG
	5′ L-VH 4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG
	5′ L-VH 5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG
κ	5′ L Vκ 1/2 ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG	3′ Cκ 543 GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA
	5′ L Vκ 3 CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG	3′ Cκ 494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT
	5′ L Vκ 4 ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG
	5′ Pan Vκ ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG
λ	5′ L Vλ 1 GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGTTG	3′ Cλ CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG
	5′ L Vλ 2 GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG
	5′ L Vλ 3 GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG
	5′ L Vλ 4/5 GGTCTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG
	5′ L Vλ 6 GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG
	5′ L Vλ 7 GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG
	5′ L Vλ 8 GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG
2amorces PCR
	Vers l'avant (5'-3')	Marche arrière (3'-5')
IgH	5′ EcoRI VH1 CAACCGGAATTCGCAGGTGCAGCTGG TGCAG	3′ NheI JH 1,2,4,5 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGT Le GACCAG
	5′ EcoRI VH1 à 5 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGCAG	3′ NheI JH 3 CTGCTAGCTAGCTGAGAGACGGTGA Le CCATTG
	5′ EcoRI VH3 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGGAG	3′ NheI JH 6 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGTG ACCGTG
	5′ EcoRI VH3 23 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCT GTTGGAG
	5′ EcoRI VH4 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCT GCAGGAG
	5′ EcoRI VH 4 34 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCTAC AGCAGTG
	5′ EcoRI VH 1 18 CTTCCGGAATTCAGGTTCAGCT GGTGCAG
	5′ EcoRI VH 1 24 CTTCCGGAATTCACAGGTCCAGCT GGTACAG
	5′ EcoRI VH3 33 CTTCCGGAATTCACAGGTGCAGCT GGTGGAG
	5′ EcoRIVH 3 9 GATCCGGAATTCAGAAGTGCAGCT GGTGGAG
	5′ EcoRI VH4 39 GATCCGGAATTCACAGCTGCAGCT GCAGGAG
	5′ EcoRI VH 6 1 GATCCGGAATTCACAGGTACAGCT GCAGCAG
κ	5′ EcoRI Vκ 1 5 CAACCGGAATTCAGACATCCAGATGA Le CCCAGTC	3′ BsiWI Jκ 1 à 4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 1 9 CTTCCGGAATTCAGACATCCAGTTGAC Le CCAGTCT	3′ BsiWI Jκ 2 GCCACCGTACGTTTGATCTCCAG CTTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 1D 43 CTTGGCGAATTCAGCCATCCGGATGA Le CCCAGTC	3′ BsiWI Jκ 3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACT TTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 2 24 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATGA Le CCCAGAC
	5′ EcoR1 Vκ 2 28 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATG ACTCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 2 30 CTTCCGGAATTCAGATGTTGTGATGA CTCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 11 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTG L’ACACAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 15 CTTCCGGAATTCAGAAATAGTGATG L’ACGCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 20 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTGA CGCAGTCT
	5′ EcoR1 Vκ 4 1 CTTCCGGAATTCAGACATCGTGATG ACCCAGTC
λ	5′ EcoR1 Vλ 1 CTTCCGGAATTCACAGTCTGTGCT GACKCAG	3′ AvrII Jλ 1 à 3 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTSACCT TGGTCCC
	5′ EcoR1 Vλ 2 CTTCCGGAATTCACAGTCTGCCC TGACTCAG	3′ AvrII Jλ 4 CTGGTTACCTAGGAAAATGATCAGC TGGGTTCC
	5′ EcoR1 Vλ 3 CTTCCGGAATTCATCCTATGAGC TGACWCAG	3′ AvrII Jλ 5 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGC TCGGTCCC
	5′ EcoR1 Vλ 4 à 5 CTTCCGGAATTCACAGCYTGTG CTGACTCA	3′ AvrII Jλ 6 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGCT GGGTGCC
	5′ EcoR1 Vλ 6 CTTCCGGAATTCAAATTTTATGC TGACTCAG	3′ AvrII Jλ 7 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAC TTGGTCCAT
	5′ EcoR1 Vλ 7 à 8 CTTCCGGAATTCACAGRCTGTG GTGACYCAG

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	Référence 10771	solution contenant du polysaccharose et du diatrizoate de sodium
Trieur de cellules FACSAria II	BD Biosciences
96 plaques à micro-puits à fond en U	Costar	Référence 3799
Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyen	Gibco, Technologies du Vivant	Référence 12633-020
Surnageant contenant 30 % v/v d’EBV de la lignée cellulaire B95-8	ATCC	CRL-1612	3,4 x 108 exemplaires/ml
CpG2006	Invivogen	ODN 7909
Cellules Wi38	Sigma-Aldrich	90020107
Interleukine-2	Roche	10799068001
Plaques ELISA	Greiner Bio-One, Microlon	655092
Fragment F(ab')2 AffiniPure IgG de chèvre anti-humain, spécifique du fragment Fcγ (non conjugué)	Jackson ImmunoResearch	Référence 109-006-008
Lait écrémé en poudre à 4 % (bloqueur de qualité buvard)	Biorad	Référence 170-6404
IgG humaines	sigma	J 2511	Immunoglobuline purifiée IgG HUMAINE, 5,6 mg/ml
IgG F(ab)2 antihumaine de chèvre Fcγ (conjuguée à la peroxydase (PO))	Jackson ImmunoResearch	Référence 109-036-008
Lecteur ELISA (Perkin Elmer 2030)	Perkin Elmer	Référence 2030-0050
AffiniPure Rabbit anti-Human IgM conjugué à la peroxydase, Fc5μ	Jackson ImmunoResearch	Référence 309-035-095
Système de synthèse directe d’ADNc de cellules SuperScript III	Invitrogen	18080-200
Applied Biosystems (ABI) Système PCR GeneAm 2700	Biosystèmes appliqués
Kit d’isolement d’ARN hautement pur	Roche	11828665001
Kit de système de transcription inverse	Promega	A3500
ADN polymérase Taq recombinante	Takara	R001A
Amorces (2μl)	sigma
Agarose ultrapure	Invitrogen	Référence 16500-500
Échelle de 100 pb	Invitrogen	Référence 15628-019
Quantité Un 4.5.2 (Gel Doc 2000)	Biorad	170-8100
Kit de purification PCR QIAquick	QIAGEN	Référence 28106
Kit de séquençage de cycle BigDye Terminator v3.1	Biosystèmes appliqués	4337455
Plaque réactionnelle de 0,1 ml (MicroAMP Optical 96 puits)	Biosystèmes appliqués	4346906
Analyseur génétique ABI300	Biosystèmes appliqués	4346906
Cellules compétentes DH5α (E. coli)	Invitrogen	Référence 18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 pb)	Invivogen	PFUSS-HCHG1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 pb)	Invivogen	PfusS-HCHG4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 pb)	Invivogen	pfuse2ss-hclk
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 pb)	Invivogen	pfuse2ss-hcll2
SOC moyen	Invitrogen	Référence 15544-034
Milieu gélosé à base de LB complété par Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)	Invivogen	Fas-Zn-S
Milieu liquide à base de bouillon formidable (TB) complété par Zeocin (Fast-Media Zeo TB)	Invivogen	Fas-zn-l
Kit de mini-préparation d’ADN	Omega Bio Technology	Réf. D6942-02
Nanodrop (spectrophotomètre ND1000)	Nanogoutte
Milieu gélosé à base de LB complété par de la blasticidine (Fast-Media Blast Agar)	Invivogen	FAS-BL-S
Milieu liquide à base de bouillon formidable (TB) complété par de la blasticidine (Fast-Media Blast TB)	Invivogen	FAS-BL-L
ÉcoRI	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	R0101S	20 000 U/ml, dans 10x NEBuffer EcoRI
NheI	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	R0131S	10 000 U/ml, dans 10x NEBuffer 2.1
Échelle d’ADN à 2 log	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	N3200S	0,1 à 10,0 kb, 1 000 μg/ml
Noël	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	R0180S	10 000 U/ml, dans 10x CutSmart Buffer
BsiWI	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	R0553S	10 000 U/ml, dans 10x NEBuffer 3.1
AvrII	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	R0174S	5 000 U/ml, dans 10x CutSmart Buffer
FastAP Phosphatase alcaline thermosensible	Thermo Scientific	EF0651	1 U/μL, dans 10 tampons FastAP
Cellules compétentes DH5α	Invitrogen	Référence 18263-012
PE souris anti-IgG humaines	BD Pharmingen	555787
anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone : HIB22	Fisher scientifique	BDB563942
QIAprep Kit Miniprep Spin	QIAGEN	Référence 27106
Terminateur BigDye v3.1	Biosystèmes appliqués	4337455