Une technologie d’hybridome pour produire des anticorps monoclonaux contre une métallopeptidase

Résumé

Source : Xia, P., et al. Production d’anticorps monoclonaux ciblant l’aminopeptidase n dans l’épithélium de la muqueuse intestinale porcine. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo présente un test permettant de produire des anticorps monoclonaux contre l’aminopeptidase porcine N (APN), une métallopeptidase liée à la membrane, à l’aide d’une technologie d’hybridome traditionnelle. Lors de l’immunisation d’une souris avec l’APN, les cellules de la rate sont récoltées et fusionnées avec des cellules de myélome immortelles pour produire des hybridomes. Les hybridomes sont ensuite sélectionnés et proliférés à l’aide du milieu HAT (hypoxanthine-aminoptérine-thymidine) pour produire des anticorps monoclonaux spécifiques à différents épitopes de la NPA.

Protocole

Toutes les procédures de modèle animal ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Immunisation animale

1. Injecter par voie sous-cutanée (s.c) à des souris BALB/c femelles, âgées de 6 à 8 semaines, 50 μg de protéine APN ou de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, contrôle négatif) mélangée à des adjuvants une fois toutes les 2 semaines. Utilisez l'adjuvant de Freund complet qui contient les mycobactéries tuées par la chaleur pour l'immunisation initiale, et l'adjuvant de Freund incomplet pour les vaccinations de rappel. Mélangez des volumes égaux de protéine APN (ou PBS) et d'adjuvant de Freund ou d'adjuvant de Freund incomplet, respectivement.
2. Détecter les titres d’anticorps contre l’APN dans le sérum de ces souris par immuno-absorption enzymatique indirecte (ELISA) à l’aide d’une plaque de microtitration recouverte de protéine APN de 5 μg/mL diluée dans 0,05 M de PBS (pH 9,6).

2. Technologie d’hybridome pour produire des anticorps monoclonaux contre l’APN

1. Par voie intrapéritonéale (i.p.), injectez 100 μg de protéine APN dans les souris sélectionnées pour une poussée finale de l’antigène.
2. Trois jours plus tard, euthanasiez les souris à l’aide de pentobarbital sodique (50 mg/kg, v/v, intrapéritonéale) et d’une luxation cervicale.
3. Prélevez la rate et lavez-vous deux fois avec du DMEM pour éliminer les cellules sanguines et graisseuses. Filtrer la suspension de cellules de rate à l’aide d’une grille de cuivre de 200 mailles pour éliminer les débris tissulaires, et prélever les cellules de la rate par centrifugation (1500 × g, 10 min) pour éliminer la membrane de la rate.
4. Implantez des cellules de myélome de souris SP2/0 dans une fiole de^{25 cm contenant} 5 mL de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 6 % de sérum fœtal bovin (FBS) et cultivez à 37 °C, 6 % de_CO2 atmosphère pour maintenir la viabilité cellulaire. Après 5 à 6 jours de culture, les cellules atteignent 80 à 90 % de confluence après la réanimation et sont en phase logarithmique de croissance. Au microscope, les cellules sont rondes, brillantes et claires.
5. Un jour avant l’hybridation, prélever les macrophages dans les cavités péritonéales des souris selon une méthode précédemment publiée.
6. Semez les macrophages péritonéaux à une densité de 0,1 à 0,2 × 10⁵/mL dans des plaques de 96 puits, chaque puits contenant 100 μL de milieu HAT (DMEM complété par 10 % de FBS et 1 supplément HAT), et incubez à 37 °C, 6 % de CO₂ sous atmosphère humidifiée pendant la nuit.
7. Pour l’hybridation, aspirez doucement les cellules SP2/0 à l’aide d’une pipette de 8 à 10 flacons et suspendez-les dans 10 ml de milieu DMEM sans sérum. Laver les cellules avec du DMEM frais, centrifuger (1500 × g, 10 min) deux fois, puis remettre en suspension dans 10 ml de DMEM.
8. Mélanger les cellules de rate quantifiées avec les cellules SP2/0 dans un rapport de 10:1 et transférer dans des tubes de 50 ml. Centrifuger (1500 × g, 10 min) et jeter le surnageant. Récupérez les granules cellulaires au fond des tubes et tapotez avec la paume pour détacher les granulés avant l’hybridation.
9. Ajouter 1 mL de polyéthylène glycol 1500 (PEG 1500), préchauffé à 37 °C, goutte à goutte à l’aide d’un compte-gouttes sur la pastille alvéolée détachée pendant une période de 45 s tout en tournant doucement le bas du tube.
10. Ajouter lentement 1 mL de DMEM préchauffé à 37 °C au mélange ci-dessus pendant une période de 90 s, suivi d’un autre 30 mL de DMEM frais. Placez le tube de fusion dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 min.
11. Après l’incubation dans le bain chaud, récoltez les cellules et mettez-les en suspension dans le milieu HAT. Puis culture dans une plaque de 96 puits inoculée avec des macrophages péritonéaux.
12. Cinq jours plus tard, ajoutez 100 μL de milieu HAT frais dans chaque puits et incubez la plaque pendant 5 jours supplémentaires, après quoi remplacez le milieu par un milieu HT (DMEM complété par 10 % de FBS et 1x supplément HT).
13. À l’aide d’une plaque de microtitration recouverte d’une protéine APN de 5 μg/mL diluée dans 0,05 M de PBS (pH 9,6), pour analyser les anticorps monoclonaux dans le surnageant de l’hybridome à l’aide d’un test ELISA.
    1. Lorsque le milieu dans les puits de la plaque de 96 puits devient jaune (en raison de la croissance cellulaire et de la libération de métabolites, le pH dans le milieu diminue à 6,8 et le rouge phénolique passe du fuchsia au jaune) ou que des amas de cellules sont observés, acquérez 100 μL de surnageant à partir des puits sélectionnés et ajoutez-le aux puits de la plaque ELISA revêtue. Utilisez un lecteur de microplaques pour mesurer les valeurs OD₄₅₀.
    2. Utilisez les anticorps polyclonaux contre l’APN et le sérum de souris non infectée comme contrôle positif et négatif, respectivement, et utilisez le PBS comme contrôle à blanc. Dans cette étude, le rapport OD₄₅₀ de l’échantillon au témoin négatif (P/N) ≥ 2,1 a été reconnu comme norme de sélection positive.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Adjuvant de Freund complet	Sigma-Aldrich	Réf. F5881	Immunisation animale
DMEM	Gibco	11965092	Culture cellulaire
DMEM-F12	Gibco	12634010	Culture cellulaire
Kit de comptage cellulaire amélioré-8	Biotechnologie Beyotime	Réf. C0042	Mesure de la viabilité et de la vitalité des cellules
Sérum fœtal bovin	Gibco	Référence 10091	Culture cellulaire
Antibiotique sélectif de™ la génétique	Gibco	11811098	Antibiotique sélectif
Supplément HAT (50X)	Gibco	21060017	Sélection de cellules
Supplément HT (100X)	Gibco	11067030	Sélection de cellules
Adjuvant de Freund incomplet	Sigma-Aldrich	F5506	Immunisation animale
Lecteur de microplaques	BioTek	BOÎTE 998	Analyse ELISA
Polyéthylène glycol 1500	Roche Diagnostics	10783641001	Fusion cellulaire
Microplaque à 96 puits	Corning	Référence 3599	Culture cellulaire