Procédé de production d’anticorps recombinants contre la métallopeptidase

Résumé

Source : Xia, P. et al., Production d’anticorps monoclonaux ciblant l’aminopeptidase N dans l’épithélium de la muqueuse intestinale porcine.J. Vis. Exp.(2021)

Cette vidéo montre une procédure de production d’anticorps recombinants contre la métallopeptidase. Les plasmides recombinants porteurs de gènes pour l’anticorps, la protéine fluorescente verte et la résistance aux antibiotiques sont transfectés dans les cellules épithéliales avec de la lipofectamine. Les cellules transfectées sont sélectionnées et cultivées pour générer des anticorps recombinants.

Protocole

1. Préparation de l’antigène de la protéine N de l’aminopeptidase porcine (APN)

REMARQUE : La souche pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) et les cellules exprimées de manière stable pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 ont été construites dans une étude précédente.

1. Récupérer les bactéries d’un stock de glycérol congelé et les laisser stagner sur des plaques Luria-Bertani (LB) contenant 50 μg/mL de kanamycine (Km⁺) pour l’isolement d’une seule colonie.
2. Sélectionner une seule colonie dans la plaque fraîchement striée, la cultiver dans 4 mL de milieu LB (10 g/L de tryptone, 10 g/L de chlorure de sodium (NaCl) et 5 g/L d’extrait de levure, pH 7,2) complété par du Km⁺ (50 μg/mL), et laisser pousser toute la nuit (12-16 h) en agitant (178 tr/min) à 37 °C.
3. Diluer les bactéries préparées à 1:100 dans un bouillon frais Km⁺ LB et incuber à 37 °C en secouant pendant 2-3 h jusqu’à ce que la DO₆₀₀ atteigne 0,4-0,6.
4. Ajouter de l’isopropyle β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) au milieu jusqu’à une concentration finale de 0,4 mM, et incuber les cultures pendant 10 h supplémentaires à 16 °C.
5. Par conséquent, centrifuger et récolter les bactéries par induction IPTG (10 000 × g, 4 °C 15 min).
6. Remettre la pastille cellulaire en suspension à l’aide de 5 mL de tampon LEW (Lysis/Equilibration/Wash) (50 mM de phosphate de sodium anhydre monobasique (NaH₂PO₄) et 300 mM de NaCl, pH 8,0) contenant 1 mg/mL de lysozyme. Agiter la suspension bactérienne pendant 30 min sur de la glace et sonicer complètement (15 s d’impulsion et 20 s d’arrêt, 15 min) à l’aide d’un homogénéisateur à ultrasons.
7. Centrifuger le lysat de cellules brutes à 4 °C et 10 000 × g pendant 30 minutes pour éliminer les débris cellulaires. Transvasez le surnageant dans une colonne pré-équilibrée et incubez 1 à 2 min avant le drainage par gravité. Répétez cette étape trois fois.
8. Lavez la colonne à l’aide de 20 ml de tampon LEW et égouttez-la par gravité. Éluer la protéine APN marquée à l’histidine à l’aide de 9 mL de tampon d’élution (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl et 250 mM d’imidazole, pH 8,0) et l’accumuler dans la tubulure de dialyse.
9. Dialyser la solution protéique pendant la nuit à 4 °C dans du carbonate de sodium-bicarbonate de sodium (solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 135 mM de NaCl, 4,7 mM de chlorure de potassium, 2 mM de NaH₂PO₄ et 10 mM de phosphate de sodium dodécahydraté dibasique, pH 7,2).
10. Analysez à l’aide d’un gel SDS-PAGE à 12,0 % et d’un western blot pour évaluer la pureté de la protéine APN.
    1. Chargez 5 μg de protéines dans chaque puits du gel et laissez fonctionner à 110 V pendant 1,5 h. Ensuite, transférez la protéine sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) pendant 50 min à 15 V. Déterminez la concentration de la protéine purifiée à l’aide d’un test d’acide bicinchoninique (BCA).

2. Immunisation animale

1. Injecter par voie sous-cutanée (s.c) des souris femelles BALB/c, âgées de 6 à 8 semaines, avec 50 μg de protéine APN ou de PBS (contrôle négatif) mélangé à des adjuvants une fois toutes les 2 semaines. Utilisez l'adjuvant de Freund complet qui contient les mycobactéries tuées par la chaleur pour l'immunisation initiale, et l'adjuvant de Freund incomplet pour les vaccinations de rappel. Mélangez des volumes égaux de protéine APN (ou PBS) et d'adjuvant de Freund ou d'adjuvant de Freund incomplet, respectivement.
2. Détecter les titres d’anticorps contre l’APN dans le sérum de ces souris par immuno-absorption enzymatique indirecte (ELISA) à l’aide d’une plaque de microtitration recouverte de protéine APN de 5 μg/mL diluée dans 0,05 M de PBS (pH 9,6).

3. Technologie d’hybridome pour produire des anticorps monoclonaux contre l’APN

1. Par voie intrapéritonéale (i.p.), injectez 100 μg de protéine APN dans les souris sélectionnées pour une poussée finale de l’antigène.
2. Trois jours plus tard, euthanasiez les souris à l’aide de pentobarbital sodique (50 mg/kg, v/v, intrapéritonéale) et d’une luxation cervicale.
3. Prélevez les rates et lavez-vous deux fois avec le Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco pour éliminer les cellules sanguines et adipeuses. Filtrer la suspension de cellules de rate à l’aide d’une grille de cuivre de 200 mailles pour éliminer les débris tissulaires, et prélever les cellules de la rate par centrifugation (1500 × g, 10 min) pour éliminer la membrane de la rate.
4. Implanter des cellules de myélome de souris SP2/0 dans une fiole de^{25 cm contenant} 5 mL de DMEM complétée par 6 % de sérum fœtal bovin (FBS) et une culture à 37 °C, 6 % d’atmosphère de dioxyde de carbone (CO₂) pour maintenir la viabilité cellulaire. Après 5 à 6 jours de culture, les cellules atteignent 80 à 90 % de confluence après la réanimation et sont en phase logarithmique de croissance. Au microscope, les cellules sont rondes, brillantes et claires.
5. Un jour avant l’hybridation, prélever les macrophages dans les cavités péritonéales des souris selon une méthode précédemment publiée.
6. Ensemencer les macrophages péritonéaux à une densité de 0,1 à 0,2 × 10,5/mL dans des plaques de 96 puits, chaque puits contenant 100 μL de milieu hypoxanthine-aminoptérine-thymidine (HAT) (DMEM complété par 10 % de FBS et 1x supplément HAT), et incuber à 37 °C, 6 % de CO₂ sous atmosphère humidifiée pendant la nuit.
7. Pour l’hybridation, aspirez doucement les cellules SP2/0 à l’aide d’une pipette de 8 à 10 flacons et suspendez-les dans 10 ml de milieu DMEM sans sérum. Laver les cellules avec du DMEM frais, centrifuger (1500 × g, 10 min) deux fois, puis remettre en suspension dans 10 ml de DMEM.
8. Mélanger les cellules de rate quantifiées avec les cellules SP2/0 dans un rapport de 10:1 et transférer dans des tubes de 50 ml. Centrifuger (1500 × g, 10 min) et jeter le surnageant. Récupérez les granules cellulaires au fond des tubes et tapotez avec la paume pour détacher les granulés avant l’hybridation.
9. Ajouter 1 mL de polyéthylène glycol 1500 (PEG 1500), préchauffé à 37 °C, goutte à goutte à l’aide d’un compte-gouttes sur la pastille alvéolée détachée pendant une période de 45 s tout en tournant doucement le bas du tube.
10. Ajouter lentement 1 mL de DMEM préchauffé à 37 °C au mélange ci-dessus pendant une période de 90 s, suivi d’un autre 30 mL de DMEM frais. Placez le tube de fusion dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 min.
11. Après l’incubation dans le bain chaud, récoltez les cellules et mettez-les en suspension dans le milieu HAT. Puis culture dans une plaque de 96 puits inoculée avec des macrophages péritonéaux.
12. Cinq jours plus tard, ajoutez 100 μL de milieu HAT frais dans chaque puits et incubez la plaque pendant 5 jours supplémentaires, après quoi remplacez le milieu par un milieu HT (DMEM complété par 10 % de FBS et 1x supplément HT).
13. À l’aide d’une plaque de microtitration recouverte d’une protéine APN de 5 μg/mL diluée dans 0,05 M de PBS (pH 9,6), pour analyser les anticorps monoclonaux dans le surnageant de l’hybridome à l’aide d’un test ELISA.
    1. Lorsque le milieu dans les puits de la plaque de 96 puits devient jaune (en raison de la croissance cellulaire et de la libération de métabolites, le pH dans le milieu diminue à 6,8 et le rouge phénolique passe du fuchsia au jaune) ou que des amas de cellules sont observés, acquérez 100 μL de surnageant à partir des puits sélectionnés et ajoutez-le aux puits de la plaque ELISA revêtue. Utilisez un lecteur de microplaques pour mesurer les valeurs de densité optique 450 (OD450).
    2. Utilisez les anticorps polyclonaux contre l’APN et le sérum de souris non infectée comme contrôle positif et négatif, respectivement, et utilisez le PBS comme contrôle à blanc. Dans cette étude, le rapport OD450 de l’échantillon au témoin négatif (P/N) ≥ 2,1 a été reconnu comme norme de sélection positive.
14. Après trois cycles de sélection positifs consécutifs, sélectionnez l’hybridome présentant une réponse sérologique accrue contre la protéine APN pour un test de dilution limité.
    1. Préparez les macrophages péritonéaux et ensemencez dans des plaques de 96 puits comme décrit précédemment.
    2. Suspendre les cellules d’hybridome dans un milieu HT à une moyenne de 0,5 à 2 cellules par puits et les cultiver dans un incubateur à 37 °C et 6 % de CO₂. Répétez cette étape trois ou quatre fois jusqu’à ce que le taux de positivité indiqué par l’immunodosage ELISA atteigne 100 %.
15. Sous la pression d’une congélation et d’une décongélation continues, sélectionnez les cellules hybridomes positives capables de sécréter de manière stable des anticorps anti-APN et de proliférer normalement.
    1. Administrer une injection intraveineuse unique de 0,3 mL de pristane à chaque souris (8 à 10 semaines). 10 jours après avoir reçu Pristine, injectez à chaque souris 2-5 x 10^{cellules d’hybridome 5} dans 0,5 ml de PBS (pH 7,2).
    2. Prélevez soigneusement le liquide péritonéal de la cavité péritonéale de ces souris 8 à 10 jours après l’injection.
    3. Récolter les surnageants par centrifugation à 5 000 × g pendant 15 minutes et purifier les anticorps contenus dans les surnageants à l’aide d’une précipitation de sulfate d’ammonium saturé à 33 % [(NH₄)₂SO₄] et d’agarose protéique A.

4. Caractérisation des anticorps monoclonaux (mAbs) contre la protéine APN

1. Déterminer le sous-type d’immunoglobuline des anticorps monoclonaux collectés à l’aide d’un système de clonotypage SBA-HRP. Utilisez SDS-PAGE et le western blot pour évaluer la pureté et la spécificité des anticorps monoclonaux.
2. Analyser la spécificité de l’épitope d’anticorps monoclonaux par rapport à la protéine APN à l’aide d’ELISA. La valeur d’additivité (AV) est le rapport entre_{les anticorps monoclonaux OD (a+b)} et (_mAbs-a+OD_mAbs-b), qui est utilisé pour évaluer si les anticorps monoclonaux reconnaissent le même site antigénique ; Les_mAbs-a OD et les_mAbs-b OD représentent les valeurs OD450 de différents anticorps monoclonaux contre l’APN seule, et_{les mAbs OD (a+b)} représentent les valeurs OD450 d’un mélange 1:1 de deux mAbs contre l’APN.
   1. Évaluez chaque échantillon au moins quatre répétitions et répétez l’expérience au moins trois fois.

5. Expression des rAbs contre l’APN

1. Extraire l’ARN total des cellules d’hybridome et de la rate mentionnées ci-dessus de souris immunisées par APN (par exemple, TRIzol). Synthétisez l'ADN complémentaire (ADNc) à l'aide d'un kit de synthèse d'ADNc selon les instructions du fabricant.
2. Amplifiez des régions variables d’anticorps monoclonaux à l’aide de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) imbriquée et déterminez les séquences de chaînes lourdes (VH) et de chaînes légères (VL) à l’aide du séquençage. Analysez les gènes codant pour VH et VL à l’aide de l’outil d’analyse du génome de souris IMGT (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
3. Combinez les gènes VH et VL avec les séquences leaders et sous-clonez-les séquentiellement dans les vecteurs pET28a (+) et pIRES2-ZsGreen1, respectivement, à l’aide d’une technologie de clonage sans couture pour permettre l’insertion de fragments d’ADN sans cicatrice. Les amorces spécifiques sont énumérées dans le tableau 1.
4. Cultivez les bactéries transformées par pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 en présence de 0,4 mM d’IPTG dans des agitateurs orbitaux à 37 °C pendant 10 h. Ensuite, induire, purifier et évaluer l’expression de la protéine rAbs à l’aide d’une purification protéique de routine.
5. Ensemencer 100 μL 0,5 x 10⁵ cellules CHO par puits dans une plaque de 96 puits et incuber à 37 °C dans une atmosphère à 6 % de CO₂ pendant 18 à 24 h. Lorsque les cellules atteignent 80-90 % de confluence, diluer le plasmide pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN avec Opti-MEM à une concentration finale de 0,1 μg/μL, et incuber 5 min à température ambiante avant de l’utiliser pour la transfection.
6. Mélangez délicatement 50 μL de plasmide dilué pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN avec 1 μL de Lipofectamine 2000 et 49 μL d’Opti-MEM et incubez le mélange pendant 20 minutes supplémentaires à température ambiante. Ajouter 100 μL de mélange dans chaque puits d’une plaque de 96 puits contenant des cellules CHO et incuber à 37 °C dans une atmosphère à 6 % de CO₂ pendant 4 à 6 h.
7. 4 à 6 h après la transfection, remplacer le milieu par du milieu DMEM-F12 complété par 10 % de FBS, et incuber la plaque pendant 48 h supplémentaires. Ensuite, ajoutez 400 μg/mL de G418 dans chaque puits pour sélectionner les cellules transfectées de manière stable.
8. Après 10 jours de sélection à l’aide d’un milieu DMEM-F12 complété par 10 % de FBS et 400 μg/mL de G418, trier les cellules (3,0 × 10⁷ cellules/mL) par tri cellulaire activé par fluorescence. Environ 10 à 15 % de la population cellulaire était positive.
9. Diluez en série les cellules positives récoltées, ensemencez à une moyenne de 0,5 à 2 cellules par puits dans une plaque de 96 puits et cultivez dans un incubateur à 37 °C et 6 % de CO₂. Maintenir les cellules pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO transfectées de manière stable en utilisant la sélection avec G418 (200 μg/mL).
La
10. concentration de FBS dans le milieu de culture cellulaire décrit ci-dessus diminue progressivement de 10 % à 0 % pendant la phase de croissance logarithmique sur une période de 3 semaines. Ensuite, adaptez les cellules CHO adhérentes à la croissance en suspension dans un milieu sans sérum.
11. Cultiver les cellules pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO ensemencées en phase de croissance logarithmique dans un milieu sans sérum à une densité de 0,8-1,0 × 10⁵ cellules/mL dans des flacons agités à une vitesse d’agitation de 80-110 tr/min et à 37°C, 6 % CO₂.
12. Prélever la suspension cellulaire toutes les 12 h pour déterminer les changements dans la viabilité et la vitalité des cellules à l'aide d'une trousse de comptage cellulaire (p. ex., CCK-8) selon les instructions du fabricant.
13. L’expression des anticorps atteint des niveaux maximaux lorsque la viabilité cellulaire diminue à 80 % et que la densité cellulaire atteint 1,0-2,0 × 10⁶ cellules/ml. Récolter les surnageants cellulaires par centrifugation, filtrer à l’aide d’un filtre à membrane en polytétrafluoroéthylène de 0,22 μm et purifier à l’aide d’agarose de protéine A.
14. Confirmez la production d’anticorps spécifiques de l’APN à l’aide de tests d’immunofluorescence indirecte (IFA).
15. Déterminez les titres d’anticorps et les affinités de liaison à l’aide du test ELISA, comme décrit précédemment. Calculez la constante de dissociation à l’équilibre (valeur K_D) des anticorps à l’aide d’une équation logistique à quatre paramètres à l’aide d’un logiciel.

Table 1. Les amorces spécifiques utilisées dans cette étude.

amorce	Séquence (5'-3')
VH-VL-F	CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG
VH-VL-R	CCGGCCACATAGGCCCCACTTGACATTGATGT
pET28a (+)-F	TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTGATTCGA
pET28a (+)-R	CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGATACCCGTATTACCC
pIRES2-ZsGreen1-F	CGACGGTACCGCGGGCGCGCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA
pIRES2-ZsGreen1-R	GGGGGGGAGGGAGAGGGGGGCGGTGGGATACCCGTATTACCC

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Adjuvant de Freund complet	Sigma-Aldrich	Réf. F5881	Immunisation animale
DAPI	Biotechnologie Beyotime	Réf. C1002	Contre-coloration nucléaire
DMEM	Gibco	11965092	Culture cellulaire
DMEM-F12	Gibco	12634010	Culture cellulaire
Dylight 549-conjugué chèvre anti-souris IgG anticorps secondaire	Abbkine	Réf. A23310	Analyse d’immunofluorescence indirecte
Kit de comptage cellulaire amélioré-8	Biotechnologie Beyotime	Réf. C0042	Mesure de la viabilité et de la vitalité des cellules
Sérum fœtal bovin	Gibco	Référence 10091	Culture cellulaire
Antibiotique sélectif de™ la génétique	Gibco	11811098	Antibiotique sélectif
Supplément HAT (50X)	Gibco	21060017	Sélection de cellules
Supplément HT (100X)	Gibco	11067030	Sélection de cellules
Adjuvant de Freund incomplet	Sigma-Aldrich	F5506	Immunisation animale
Isopropyle β-d-1-thiogalactopyranoside	Sigma-Aldrich	I5502	Expression des protéines
kanamycine	Biotechnologie Beyotime	ST102	Antibiotique bactéricide
Microscope confocal Leica TCS SP8 STED	Microsystèmes Leica	SP8 STED	Imagerie par fluorescence
Réactif Lipofectamine® 2000	Thermopêcheur	11668019	transfection
LSRFortessa™ tri cellulaire activé par fluorescence	Bd	FACS LSRFortessa	Cytométrie en flux
Lecteur de microplaques	BioTek	BOÎTE 998	Analyse ELISA
Micro spectrophotomètre	Thermo Fisher	Nano Drop un	Détection de la concentration d’acide nucléique
NaCl	Réactif chimique Sinopharm	10019308	Bouillon de culture
(NH4)2SO4	Réactif chimique Sinopharm	10002917	Bouillon de culture
Opti-MEM	Gibco	31985088	Culture cellulaire
Polyéthylène glycol 1500	Roche Diagnostics	10783641001	Fusion cellulaire
Kit de synthèse d’ADNc 1er brin PrimeScript™	Biographie de Takara	RR047	qPCR
Protéine A agarose	Biotechnologie Beyotime	P2006	Purification des protéines d’anticorps
Colonnes garnies Protino® Ni+-TED 2000	MACHEREY-NAGEL	Référence 745120.5	Purification des protéines
Système de clonotypage SBA-HRP	Biotech du Sud	Mai-00	Isotypage d’anticorps monoclonaux de souris
Kit de clonage sans couture	Biotechnologie Beyotime	D7010S	Construction des plasmides
Fioles agitées	Biotechnologie Beyotime	E3285	Culture cellulaire
Tampon carbonate de sodium-bicarbonate de sodium	Biotechnologie Beyotime	Réf. C0221A	Culture cellulaire
Cellule de transfert semi-sèche Trans-Blot SD	Bio-rad	170-3940	Transfert Western
Tryptone	Oxoïde	Réf. LP0042	Bouillon de culture
Homogénéisateur à ultrasons	Ningbo Xinzhi Biotechnologie	JY92-IIN	Homogénéisation des échantillons
Extrait de levure	Oxoïde	LP0021 (en anglais	Bouillon de culture
Microplaque à 96 puits	Corning	Référence 3599	Culture cellulaire

)