Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Isolement des PBMC et enrichissement/purification des cellules NK
REMARQUE : D’autres méthodes d’isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) et d’enrichissement/purification peuvent également être effectuées.
- Prélever 200 ml de sang dans des conditions réglementées dans un tube contenant de l’héparine.
- Ajouter 15 mL du milieu à gradient de densité dans un tube de 50 mL auquel est incorporé une barrière poreuse. Faites tourner le tube à 1000 x g pendant 30 s.
- Ajoutez 12,5 ml de sang dans le tube, suivi de 12,5 ml de PBS, et retournez doucement 3x. Faites tourner le tube à 800 x g pendant 15 min à température ambiante (RT) sans pause.
- Préparez un tube conique de 50 ml avec 40 ml de PBS pour chaque tube avec une barrière poreuse pendant que les cellules tournent.
- Retirez soigneusement les tubes et inspectez-les après la centrifugation. Vérifiez qu’il n’y a pas une fine couche de PBMC visiblement blanche au-dessus de la barrière poreuse, entre les démarcations de 20 mL et de 25 mL sur le tube de 50 mL.
- Retirez soigneusement autant de liquide que possible du haut à l’aide d’une pipette sans perturber la fine couche blanche de PBMC.
- À l’aide d’une pipette sérologique propre de 10 ml, retirez délicatement la couche de PBMC en plus de la couche de liquide clair et jaunâtre jusqu’au filtre du tube.
- Expulser les PBMC et le liquide dans le cône de 50 mL contenant du PBS préparé à l’étape 1.4. Essorage des tubes à RT et 300 x g pendant 5 min.
- Aspirez le nettoyant PBS et ajoutez 40 ml supplémentaires de PBS. Essorage des tubes à RT et 300 x g pendant 5 min.
- Après le lavage, comptez les cellules et mettez-les en suspension dans 40 μL de BSA/PBS à 2 % par 1 x 107 cellules.
- Procéder à l’isolement des cellules NK en utilisant la méthode de votre choix. Les choix incluent le tri manuel ou automatisé à base de billes magnétiques. Un tri cellulaire activé par fluorescence peut également être effectué.
- Prélever une petite aliquote de cellules pour déterminer la pureté des cellules NK par cytométrie en flux. La stratégie de contrôle comprend les éléments suivants : gate sur les cellules vivantes en fonction du profil de diffusion vers l’avant ou sur le côté, puis évaluation de la pureté en fonction des marqueurs NK (par exemple, CD3, CD56) dans la population vivante spécifique. La pureté typique est de >95 %.
- Une fois l’isolement terminé, faites tourner les cellules à RT et 300 x g pendant 5 min pour granuler et aspirer.
- Remettre en suspension la pastille cellulaire à 1 x 107 cellules/mL dans RPMI 1640 avec des nutriments, 10 % de FBS inactivé par la chaleur, 1 mM de pyruvate de sodium, 55 mM de 2-ME et 10 mM d’HEPES (pH = 7,2).
2. Activation des cellules NK par anticorps via FcγRIIIa
- Réglez une microcentrifugeuse réfrigérée à 4 °C.
- Distribuer 1 x 106 (100 μL de) cellules NK remises en suspension dans un ou plusieurs tubes de 1,5 mL et les placer sur ice.
note: Les cellules peuvent être distribuées dans une plaque à fond en U de 96 puits s’il y a de nombreux échantillons.
- Préparez 1 μL de rituximab (ou d’anticorps d’intérêt) de 100 μg/mL par échantillon et ajoutez 1 μL aux cellules pour obtenir une concentration finale de 1 μg/mL d’anticorps.
note: D’autres molécules peuvent être ajoutées aux cellules à ce stade ou plus tôt pour l’évaluation des effets combinés. Ici, le ritixumab a été utilisé pour la stimulation. Dans des études antérieures, des inhibiteurs de petites molécules ont été ajoutés aux stimulations.
- Incuber l’échantillon sur de la glace pendant 30 min. Pendant l’incubation, préparer 50 μL d’anticorps anti-chaînes légères κ humaines à 50 μg/mL par échantillon dans un milieu et à chaud à 37 °C sur un bloc chauffant ou dans un bain-marie.
- Après l’incubation des cellules sur de la glace, ajouter 1 mL de milieu glacé et essorer à 135 x g pendant 5 min à 4 °C. Laver à nouveau avec 1 mL de milieu glacé.
- Aspirer le surnageant après le dernier lavage et ajouter 50 μL du mélange de chaînes légères κ anti-humain préparé à l’étape 2.4.
- Incuber immédiatement des échantillons pour les points temporels déterminés par l’utilisateur final à 37 °C sur un bloc chauffant ou dans un bain-marie.
- Arrêtez la stimulation en ajoutant 1 mL de média glacé et faites tourner immédiatement les échantillons dans une centrifugeuse réfrigérée à 135 x g pendant 5 min. Lavez une fois de plus avec 1 mL de média glacé.
