Technique de génération d’anticorps monoclonaux à partir de lymphocytes B spécifiques de l’antigène

Résumé

Source : Devilder, M., et al. Génération d’anticorps monoclonaux humains discriminants à partir de lymphocytes B spécifiques d’antigènes rares circulant dans le sang. J. Vis. Exp. (2018).

La vidéo montre une technique de génération d’anticorps monoclonaux à partir de lymphocytes B spécifiques de l’antigène. Des vecteurs d’expression eucaryotes codant pour les chaînes lourdes et légères d’anticorps, clonés à partir de lymphocytes B spécifiques de l’antigène isolés, sont introduits dans des cellules de mammifères à l’aide de polyplexes. Une fois à l’intérieur des cellules, ces vecteurs subissent une traduction, et les peptides à chaîne lourde et légère qui en résultent s’assemblent en anticorps, qui sont ensuite sécrétés par les cellules.

Protocole

1. Production d’anticorps monoclonaux

1. La veille de la transfection, ensemencez 15 000 cellules de rein embryonnaire humain 293A (HEK 293A) dans 200 μL de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de FBS par puits dans des plaques de 96 puits. Incuber une nuit dans un incubateur de CO₂ (5 % de CO₂) à 37 °C.
2. Cellules Cotransfect 293A dans un milieu DMEM contenant 10 % de FBS à l’aide d’un dérivé linéaire de polyéthylénimine comme réactif de transfection.
   note: Effectuez la transfection en trois exemplaires. Le protocole suivant s’applique à un puits d’une plaque à fond plat de 96 puits.
   1. Diluer 0,5 μL de réactif de transfection de l’ADN dans 10 μL de 150 mM de NaCl. Diluer 0,125 μg de chaîne lourde variable (vH) et 0,125 μg de chaîne légère variable (vL) exprimant des vecteurs en 10 μL de 150 mM de NaCl. Vortex à chaque dilution pendant 10 s.
   2. Ajouter 10 μL de réactif de transfection d’ADN dilué dans la solution d’ADN 10 μL. Vortex 15 s et incuber pendant 15 min à température ambiante. Ajouter les 20 μL de mélange goutte à goutte sur des cellules 293A et mélanger en remuant doucement la plaque.
3. Remplacer le milieu 16 h après la transfection et cultiver les cellules pendant 5 jours dans un milieu sans sérum.
   note: Utilisez un milieu sans sérum pour éviter que les immunoglobulines sériques (Ig) ne contaminent les anticorps produits.
4. Éliminer les cellules et les débris par centrifugation à 460 x g pendant 5 min.
5. Récoltez les surnageants par aspiration à l’aide d’une pipette multicanaux et transférez-les dans une plaque à fond en V de 96 puits.
6. Enrober l’Ag pertinent pendant la nuit à 4 °C dans 100 μL par puits de tampon de revêtement ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) / ELISPOT (Enzyme-linked Immunosorbent spot) reconstitué 1x à une concentration finale de 2 μg/mL dans des plaques ELISA à 96 puits.
7. Boucher les puits avec un milieu DMEM FBS à 10 % pendant 2 h à 37 °C.
8. Ajouter 50 μL de surnageants de cellules 293A transfectées à partir de l’étape 1.5 et incuber pendant 2 h à RT.
9. Ajouter 100 μL d’un anticorps anti-immunoglobuline G humaine (IgG Ab) conjugué à l’enzyme peroxydase de raifort (HRP) à 1 μg/mL et incuber pendant 1 h à température ambiante. Ajouter 50 μL de substrat chromogène (3,3',5,5' tétraméthylbenzidine, TMB) et incuber pendant 20 min.
10. Lire les densités optiques à 450 nm sur un spectrophotomètre.
    note: Les anticorps monoclonaux spécifiques révélés par le test ELISA peuvent être produits à grande échelle et purifiés sur une colonne de protéine A présentant une affinité pour les IgG humaines.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lignée cellulaire HEK 293A	Thermo Fisher scientifique	Réf. R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco par life technologies	Référence 21969-035	(+) 4,5g/L de D-Glucose 0,11g/L de pyruvate de sodium (-) L-Glutmine
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Conc
Sérum fœtal bovin (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500
Réactif de transfection d’ADN Jet PEI	PolyPlus	101 à 40
Plaque à fond platPlaque à 96 puits	Faucon	353072
Plaque à fond en V à 96 puits	Nunc/Thermofisher	Référence 55142