Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des cathéters étagés
- Préparation d’un tube en silice fondue pour l’étape du cathéter
- Coupez le capillaire en silice fondue d’un diamètre intérieur de 0,1 mm et d’une épaisseur de paroi de 0,0325 mm sur une longueur de 30 mm.
- Examinez le tube à la recherche de fissures et polissez à la chaleur les extrémités à l’aide d’une microforge pour vous assurer que les ouvertures du tube ont une surface lisse.
- Fixation de la chambre à air dans une aiguille métallique
- Montez une aiguille de 27 G sur une seringue de 10 μL et placez la seringue dans un robot stéréotaxique.
- À l’aide du robot, déplacez la seringue sur une surface dure et touchez-la avec la pointe de l’aiguille. Cette position doit être notée ou enregistrée dans le logiciel car elle servira de surface de référence pour le réglage de la longueur du pas du cathéter.
- Surélevez l’aiguille pour permettre au capillaire de silice fondue d’être placé à l’intérieur de l’aiguille.
- Placez le capillaire de silice fondue dans l’aiguille de manière à ce que 20 mm du capillaire dépassent de l’aiguille.
- À l’aide d’une pipette, étalez uniformément 2 μL d’adhésif cyanoacrylate à haute viscosité sur le capillaire, en commençant par l’aiguille métallique et en terminant à 10 mm au-dessus de l’extrémité inférieure du capillaire, comme illustré à la figure 1.
- À l’aide du robot stéréotaxique, abaissez l’aiguille jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille métallique dépasse de 1 mm la surface de référence. De cette façon, le capillaire en silice fondue sera fixé dans l’aiguille métallique, formant un pas de 1 mm à partir de la pointe. Retirez tout excès de colle qui se forme à l’extrémité de l’aiguille métallique pour éviter d’émousser la marche.
- Attendez 15 min que la colle durcisse et retirez la seringue avec le cathéter du robot stéréotaxique. Vérifiez que tout l’excès de colle a été enlevé à l’étape en vérifiant l’extrémité du cathéter au microscope.
- Test du cathéter étagé à l’aide d’un bloc d’agarose
- Préparez une solution d’agarose à 0,6 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans un plateau de gel conventionnel et attendez qu’elle polymérise. Coupez l’agarose en blocs d’environ 20 mm x 20 mm. Jusqu’à l’utilisation, gardez les blocs immergés dans le PBS.
- Remplissez manuellement la seringue du cathéter étagé avec 10 μL de solution à 0,4 % de bleu de trypan filtré.
- À l’aide du robot stéréotaxique, distribuer 1 μL à 0,2 μL/min pour évaluer l’étanchéité de l’étape du cathéter pendant la procédure de fixation. La solution de bleu de trypan doit être visible uniquement sur l’extrémité du cathéter. Essuyez-le avec un mouchoir en papier.
- Placez le bloc d’agarose dans le robot stéréotaxique et calibrez le robot de manière à ce que l’extrémité du cathéter soit référencée contre la surface du bloc d’agarose.
- Programmez les paramètres d’injection pour CED.
- Pour un volume d’injection de 5 μL, utilisez les étapes suivantes : 1 μL à 0,2 μL/min, puis 2 μL à 0,5 μL/min et 2 μL à 0,8 μL/min. Ajustez le volume d’injection final en fonction du plan d’expérience spécifique en modifiant proportionnellement la durée de chacune des étapes.
- Pour injecter la solution dans un putamen caudé murin (striatum), effectuez cette injection dans une position de 1 mm en avant et de 1,5 à 2 mm sur le côté latéral du bregma à une profondeur de 3,5 mm.
- Après l’injection, laissez le cathéter en place pendant 2 min, puis rétractez-le à 1 mm/min pour assurer une bonne dispersion du liquide dans le cerveau et sceller le conduit d’injection lors du retrait du cathéter.
note: Tous les paramètres peuvent être programmés dans un seul script en fonction du robot stéréotaxique spécifique.
- Commencer la procédure CED et injecter 5 μL de solution de bleu de trypan dans le bloc d’agarose.
- Évaluez la forme d’un nuage de bleu trypan dans l’agarose et les fuites potentielles le long du cathéter. Le bleu trypan doit former un ellipsoïde ou un nuage rond avec le centre autour de l’extrémité du cathéter et un diamètre d’au moins 1 mm. Aucun reflux important sur la pointe de l’aiguille métallique ne doit être visible.
- Placez un nouveau bloc d'agarose et commencez une deuxième injection de 1 μL à 0,2 μL/min pour évaluer l'obstruction du cathéter avec l'agarose. Le bleu de trypan doit recommencer à former un nuage à partir de l’extrémité du cathéter immédiatement après le début de l’injection.
- Évaluez si le volume restant dans la seringue correspond à 3 μL. Toute variation peut indiquer une fuite de liquide à travers le support du cathéter ou le piston de la seringue.
- Si toutes les injections d’essai réussissent, le cathéter est bien scellé et droit, et aucune solution de bleu de trypan n’est observée à d’autres endroits que l’extrémité du cathéter, lavez le cathéter avec du H2O désionisé (dH2O) jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de traces de bleu de trypan visibles, puis lavez dix fois comme suit : 70 % d’éthanol et 100 % d’éthanol, suivi d’un nouveau rinçage avec de l’éthanol à 70 % et de l’eau déminéralisée propre.
- Rangez le cathéter dans des conditions sèches.
2. Livraison par convection d’une solution d’anticorps dans le cerveau murin
REMARQUE : Selon les réglementations locales en matière de bien-être animal, différents types d’anesthésiques, d’analgésiques et d’antibiotiques peuvent être mis en œuvre pour cette procédure. Ce protocole décrit l’utilisation de l’anesthésie par injection. Les anesthésiques par inhalation tels que l’isoflurane peuvent également être utilisés en montant un masque nasal sur le cadre stéréotaxique. De plus, nous recommandons d’ajouter des antibiotiques à l’eau potable pour la prophylaxie des infections.
- Configuration chirurgicale
- Préparez des anesthésiques et des solutions antidote. Les souris peuvent être anesthésiées en toute sécurité à l’aide d’un anesthésique à trois composants contenant du fentanyl (0,05 mg/kg), du midazolam (5 mg/kg) et de la médétomidine (0,5 mg/kg) dilués dans de l’eau distillée stérile (dH2O). Nous effectuons une procédure de réveil en deux étapes à l’aide de deux solutions d’antidote, l’une contenant du flumazénil (0,5 mg/kg) et de la buprénorphine (0,1 mg/kg) dans du dH2O stérile (première solution d’antidote). Le second contient de l’atipamézole (2,5 mg/kg) dans du dH2O stérile (deuxième solution d’antidote).
- Préparez une solution analgésique contenant du carprofène (5,667 mg/kg) diluée avec du dH2O stérile.
- Nettoyez le cadre stéréotaxique, le coussin chauffant et les éléments du robot stéréotaxique. Gardez à l’esprit que toutes les pièces du robot ne peuvent pas être nettoyées sans risque d’être endommagées. Reportez-vous au manuel du robot pour plus de détails sur le nettoyage et la préparation à l’utilisation.
- Assemblez la seringue avec le cathéter étagé et rincez-la plusieurs fois avec du dH2O, de l’éthanol à 70 % et de l’éthanol à 100 %, puis rincez à nouveau avec de l’éthanol à 70 % et du dH2O. Enfin, rincez la seringue avec du PBS ou d’autres tampons pour préparer la solution pour l’injection intracrânienne, par exemple du liquide céphalo-rachidien artificiel. Le piston de la seringue doit se déplacer en douceur et librement pendant la procédure.
- Calibrez le logiciel du robot stéréotaxique avec le cadre stéréotaxique.
- Testez le logiciel du robot stéréotaxique en vous assurant que les bras du robot se déplacent librement, que la pompe d’injection est correctement connectée et qu’elle peut effectuer la procédure CED sans aucune perturbation. Cela comprend le test du mouvement du robot, l’injection en rampe, la vérification de l’étape d’attente de 2 minutes et la vérification de la vitesse de rétraction du cathéter. Tous les paramètres doivent correspondre à la procédure CED préprogrammée décrite au point 1.3.5.
- Insérez le foret dans la perceuse. Il est recommandé de stériliser les forets avant utilisation.
- Préparez une solution d’anticorps à l’aide de PBS ou d’autres solutions tampons telles que du liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF). 1 à 20 μg d’anticorps dans 5 μL peuvent être injectés en une seule procédure CED. D’autres volumes et quantités de protéines doivent être testés avant d’effectuer l’expérience. Sachez que l’utilisation de solutions à haute viscosité peut entraîner le colmatage du cathéter.
- Chargez manuellement la seringue avec l’anticorps dilué.
- Injection d’anticorps par CED dans le striatum
- Pesez la souris et injectez la solution d’anesthésie à trois composants dans le péritoine en fonction du poids corporel. Notez le temps d’injection. Transférez la souris dans une cage séparée chauffée avec un coussin chauffant.
- Observez la souris pour déterminer quand la sédation commence. Lorsque la souris cesse de bouger, appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour protéger la cornée du dessèchement pendant la chirurgie. La sédation complète commence généralement 10 à 15 minutes après l’injection de la solution d’anesthésie à trois composants.
- Vérifiez les réactions à la douleur à l'aide du test du réflexe de pincement pour vous assurer que l'animal est complètement anesthésié.
- Rasez la tête à l’aide d’une tondeuse à cheveux.
- Désinfectez la peau avec des cotons-tiges imbibés d’une solution iodée. Frottez la peau trois fois dans un mouvement circulaire.
- Faites une incision cutanée de 10 mm le long de la ligne médiane du crâne, en terminant au niveau des yeux à l’aide d’un scalpel.
- Fixez la souris dans le cadre stéréotaxique à l’aide du pince nasal et des barres d’oreille. Assurez-vous que la surface du crâne est horizontale et bien fixée. Outre une navigation anatomique correcte, il est également crucial d’éviter d’incliner le crâne pendant le forage et la procédure CED.
- Placez la seringue dans le robot stéréotaxique.
- Synchronisez le foret avec la pointe du cathéter sur un point de référence. La relation entre la position de la perceuse et de la seringue doit être déterminée avec précision dans le logiciel afin que l’injection puisse être effectuée dans la région anatomique souhaitée du cerveau.
- Rétractez la peau à l'aide d'une pince et localisez le bregma à la surface du crâne.
- Référence Bregma dans le logiciel à l’aide de la pointe de la mèche.
- Déplacez la perceuse à une position de 1 mm frontale et latérale de 2 mm par rapport au bregma et percez un trou de bavure. Attention à ne pas endommager la dure-mère.
- Déplacez la seringue sur le trou de la bavure.
- Distribuez 0,5 à 1 μL de la seringue pour vous assurer qu’il ne reste pas de bulles d’air dans le cathéter.
- Démarrer le programme CED décrit au point 1.3.5. Observez la surface du crâne pour toute trace de reflux de liquide du point d’injection. Surveillez le rythme respiratoire de l’animal.
- Une fois le programme de CED terminé et le cathéter retiré du cerveau, démarrez la pompe d’injection à 0,2 μL/min pour vérifier s’il n’y a pas d’obstruction du cathéter pendant le CED. Si aucun colmatage ne s’est produit, vous devriez immédiatement voir une gouttelette de mélange d’injection provenant de l’extrémité du cathéter.
- Avant de réutiliser ou de ranger le cathéter, examinez visuellement l’étape du cathéter au microscope pour détecter tout signe de dommage ou d’usure et nettoyez-le comme à l’étape 1.3.10.
