Un test cellulaire pour évaluer l’absorption de la protéine tau par la microglie

1. Culture de cellules microgliales BV-2

REMARQUE : Manipulez les cellules BV-2 sous confinement de niveau de biosécurité 2. La lignée cellulaire BV-2 produit un rétrovirus écotrope recombinant enveloppé (capable d’infecter uniquement les cellules murines) ; Ces virus sont connus pour leur capacité de transformation in vitro et leur potentiel tumorigène in vivo.

1. Cultivez des cellules BV-2 dans un milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) à haute teneur en glucose complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 2 mM de L-glutamine (ci-après dénommé milieu de culture) en ensemencant des cellules à raison de 4 x 10⁴ cellules/mL.
2. Maintenir les cultures dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂ à 37 °C.
   REMARQUE : les cellules se développent lâchement attachées et en suspension.

2. Étiqueter les agrégats Tau recombinants avec un colorant fluorescent sensible au pH

NOTE : Les agrégats de tau ont été préparés comme décrit dans Apetri et al.à la différence qu’aucun Thioflavin T (ThT) n’a été ajouté au tampon de réaction. Les échantillons agrégés ont été prélevés dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL. Le signal de fluorescence final a été vérifié en mélangeant 118 μL de l’échantillon du pool avec 12 μL d’une solution de ThT de 50 μM. Les agrégats ont été séparés par centrifugation du mélange de réaction d’agrégation à 20 000 x g pendant 1 h à 4 °C. Le surnageant a été analysé par SEC-MALS pour confirmer que toute la protéine tau monomère a été convertie en agrégats. Les granulés (agrégats tau) ont été congelés et conservés dans un congélateur à -80 °C.

1. Mettre en suspension les agrégats de tau dans un tampon de bicarbonate de sodium 0,1 M (NaHCO₃) à pH 8,5 jusqu’à une concentration de 1 mg/mL (~ 20 μM).
   note: La concentration des agrégats de tau est basée sur la concentration initiale de monomères telle qu’évaluée par l’absorption des monomères de tau à 280 nm à l’aide d’un coefficient d’extinction de 0,31 ^{mLmg-1 cm-1}.
2. Soniquer les agrégats remis en suspension à l’aide d’une sonde tout en les maintenant sur la glace pour éviter la surchauffe.
   1. Utilisez une amplitude de 65 % (avec un sonicateur de puissance 250 W).
   2. Effectuez 8 impulsions de 3 s avec des pauses de 15 s entre les impulsions pour éviter la surchauffe.
3. Préparez une solution mère de 8,9 mM de colorant sensible au pH (ci-après appelé colorant de pH) dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) en suivant les instructions du fabricant.
   note: Préparez toujours une solution fraîche et n’utilisez-la que le jour de sa préparation.
4. Ajouter 10 moles de colorant par mole de protéine à une concentration finale de colorant de 0,2 mM.
5. Mélangez en pipetant doucement de haut en bas.
6. Incuber le mélange réactionnel pendant 45 à 60 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière.
7. Pendant ce temps, assemblez une colonne de dessalage en gel de dextran réticulé en suivant les instructions du fabricant.
8. Équilibrez la colonne avec 25 mL de tampon 0,1 M NaHCO₃ pH 8,5 contenant 3 % de DMSO. Jetez le flux.
9. Ajouter le produit de la réaction d’étiquetage des agrégats tau à la colonne dans un volume total de 2,5 mL. Si la quantité de l’échantillon est inférieure à 2,5 ml, ajouter un tampon jusqu’à ce qu’un volume total de 2,5 ml soit atteint.
10. Laissez l’échantillon pénétrer complètement dans le gel emballé, jetez l’écoulement.
11. Eluter avec 3,5 mL de tampon NaHCO₃ 0,1 M pH 8,5 contenant 3 % de DMSO et recueillir l’éluat en 4 fractions équivalentes dans des tubes de 2 mL.
12. Déterminer les concentrations protéiques des 4 fractions à l’aide d’un dosage de l’acide bicinchoninique (BCA).
13. Conservez les protéines étiquetées dans un congélateur à -20 °C.

3. Dosage de l’absorption avec lecture du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

1. Jour 1 – Ensemencer les cellules
   1. Laver les cellules BV-2 dans le ballon en prélevant le milieu de culture et en ajoutant 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
      note: Le volume de lavage variera en fonction de la taille de la fiole utilisée. Par exemple, pour une fiole T175, laver avec 10 mL de 1x PBS.
   2. Retirer le PBS de la fiole et détacher les cellules en les incubant avec de l’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,05 % à 37 °C et 5 % de CO₂ jusqu’à ce que les cellules se détachent de la fiole (environ 5 min).
      note: Le volume de trypsine-EDTA 0,05 % dépend de la taille de la fiole utilisée. Par exemple, pour une fiole T175, utilisez 2 mL de trypsine-EDTA 0,05 %.
   3. Remettre les cellules en suspension dans le milieu de culture en pipetant de haut en bas trois à cinq fois.
      REMARQUE : Le volume du milieu de culture varie en fonction de la taille de la fiole utilisée et donc du nombre total de cellules dans la fiole. Par exemple, pour une fiole T175, utilisez 8 mL de milieu de culture.
   4. Compter les cellules et créer une suspension cellulaire avec une concentration finale de 1 x 10⁵ cellules/mL dans un milieu de culture contenant 200 μg/mL d’héparine.
   5. Plaque de 250 μL de suspension cellulaire (2,5 x 10⁴ cellules) par puits dans une plaque à fond plat de culture tissulaire de 96 puits.
   6. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 °C et 5 % CO₂.
2. Jour 1 – Préparer les immunocomplexes
   1. Décongeler le pH colorant-tau sur de la glace.
   2. Préparer 65 μl par condition d’une solution de 500 nM d’agrégats de colorant-tau de pH dans un milieu sans sérum (DMEM à haute teneur en glucose complété par 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 200 μg/mL d’héparine).
   3. Préparez des dilutions d’anticorps dans 65 μl de SFM à une concentration deux fois supérieure à la concentration finale. Mélangez le pH, les agrégats de colorant-tau et les anticorps dans une plaque à fond en U de 96 puits. Le volume final par condition est maintenant de 130 μl et la concentration en agrégats de colorant-tau est de 250 nM. Scellez la plaque de dilution et incubez pendant une nuit à 37 °C.
3. Jour 2 – Absorption des immunocomplexes
   1. Retirez le milieu de culture des cellules BV-2. Lavez les cellules une fois avec 100 μL à température ambiante 1x PBS.
   2. Transférez 125 μL d’immunocomplexes dans les cellules à l’aide d’une pipette multicanaux. Incuber les cellules avec les immunocomplexes pendant 2 h à 37 °C et 5 % de CO₂.
   3. Retirez le milieu d’incubation des cellules et jetez-le. Lavez les cellules une fois avec 100 μL à température ambiante 1x PBS.
   4. Retirez 1x PBS et traitez les cellules avec 50 μL de trypsine-EDTA 0,25 % pendant 20 min à 37 °C et 5 % de CO_2.
   5. Ajouter 200 μL de milieu de culture et bien remettre en suspension en pipetant de haut en bas pour détacher les cellules. Transférez les cellules sur une plaque à fond en U de 96 puits. Plaque de centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
   6. Mettez la plaque sur de la glace, retirez le milieu de culture et lavez les cellules deux fois en remettant les granulés de cellules en suspension dans 150 μL de glace froide 1x PBS. Plaque de centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
   7. Mettez les cellules sur de la glace, retirez 1x PBS ajouté et lavez-les en les remettant en suspension dans un tampon FACS froid de 150 μL (1x PBS, 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA), 2 mM EDTA). Plaque de centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
   8. Mettez les cellules sur de la glace, retirez le tampon FACS ajouté et remettez les cellules en suspension dans un tampon FACS froid de 200 μL.
   9. Analysez immédiatement les échantillons en acquérant 2 x 10^{événements 4} dans la porte des cellules vivantes (voir étape 4.1).