1. Purification de l’anticorps
REMARQUE : Le tampon d’équilibrage pour l’anticorps interne est de 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,5. Le tampon d’élution utilisé est de l’acide acétique 0,1 M. Les tampons et la résine (protéine A) dépendent de l’anticorps spécifique purifié. Le volume de la colonne est équivalent à la hauteur du lit de la résine. La quantité de phase mobile utilisée est déterminée en termes de volume de colonne.
- Initialisation du système de purification
- Ouvrez le logiciel connecté au système de purification. À l’aide d’instructions manuelles, équilibrez la colonne avec le tampon d’équilibrage à un débit de 2 mL/min pendant 40 min. Arrêtez le cycle manuel après l’équilibrage.
- Dans le collecteur de fractions, placez des tubes coniques de 15 mL pour recueillir l’éluat d’anticorps purifié et des tubes coniques de 50 mL pour recueillir l’écoulement pendant le lavage à haute teneur en sel. Assurez-vous que le collecteur de fractions est réinitialisé à la position de départ en l’ouvrant et en le fermant avant de commencer l’exécution. Le collecteur de fractions est maintenu à 7 °C.
note: Le collecteur de fractions peut être réinitialisé manuellement sous l’onglet Collecteur de fractions dans les paramètres, pour les tubes de 15 ml et de 50 ml.
- Injection d’échantillons
note: Le liquide de culture cellulaire récolté utilisé dans les procédures suivantes a été obtenu à partir de cellules ovariennes de hamster chinois cultivées dans des micro-bioréacteurs automatisés.
- Ajouter le liquide de culture cellulaire de récolte filtré de 0,22 μm dans une seringue vide de 12 mL dont l’extrémité de la buse est bouchée.
- En tenant la seringue avec la buse vers le bas, insérez le piston de la seringue jusqu’à ce qu’une petite partie du piston soit à l’intérieur. En vous assurant que le liquide ne fuit pas, tournez la seringue avec la buse vers le haut et retirez le bouchon.
- Toujours en tenant la seringue avec la buse vers le haut, poussez le cylindre pour dissiper l’air jusqu’à ce que le liquide de culture cellulaire se trouve à l’extrémité de la buse. Insérez la buse de la seringue dans l’orifice d’injection manuelle du système de purification et tournez-la pour serrer.
- Appuyez sur le piston jusqu’à ce que tout l’échantillon soit injecté et visible dans la boucle d’échantillonnage de grand volume de 10 ml attachée.
- Ouvrez le fichier de méthode enregistré. Enregistrez le fichier de résultat à l’emplacement requis et spécifiez le nom du fichier lorsque vous y êtes invité. Appuyez sur Run une fois que l’échantillon a été injecté dans la boucle d’échantillonnage de grand volume.
- Exécution de la méthode de purification
- Sélectionnez la méthode enregistrée et cliquez sur exécuter lorsque le logiciel de l’instrument vous le demande (étape 1.2.5).
note: Le système est configuré pour exécuter les étapes suivantes. L’utilisateur n’a rien à faire pendant que l’instrument fonctionne.
- Équilibrer la colonne avec trois volumes de colonne (CV) de tampon d’équilibrage à un débit de 2 mL/min. Une fois la colonne équilibrée, le système, à l’aide de la boucle d’échantillonnage de grand volume, injectera l’échantillon dans la colonne à un débit de 1 mL/min.
- Une baisse du signal UV à 280 nm indique que le chargement de l’échantillon est terminé. Lavez la colonne avec un tampon d’équilibrage à un débit de 2 mL/min jusqu’à ce que le signal UV descende en dessous de 25 mAU.
- Utilisez quatre CV de 25 mM de Tris avec 1 M de NaCl à un pH de 7,5 pour effectuer un lavage secondaire à haute teneur en sel à un débit de 2 mL/min. Le collecteur de fractions du système recueillera toutes les protéines/ADN qui se détachent de la colonne pendant le lavage au sel dans des tubes de 50 ml.
- Appliquer cinq CV de tampon d’élution à un débit de 1 mL/min pour éluer l’anticorps de la colonne. Prélever l’éluat dans des tubes de 15 mL en fonction du signal UV ; lorsque le signal UV 280 est supérieur à 35 mAU, la collecte commence ; la collecte se termine lorsque le signal descend en dessous de 50 mAu ; C’est ce qu’on appelle la coupe de pointe.
note: La coupe des pics assure la normalisation des profils d’élution et évite les résidus de pics d’élution qui peuvent contenir des agrégats de protéines.
- Lavez la colonne à l’aide de trois CV de tampon d’équilibrage. Le cycle se termine après l’étape de lavage.
- Après l’élution, neutralisez immédiatement la protéine purifiée à l’aide de 1 M de base Tris à un pH de ~5,5. Mesurez la concentration en protéines à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis microvolume à 280 nm et 260 nm et stockez-la à 4 °C.
