Un test pour mesurer le titre d’anticorps neutralisants spécifiques du virus respiratoire syncytial

Résumé

Source : Do, L. A. H., et al., Un test de micro-neutralisation du virus respiratoire syncytial (VRS) amélioré et à haut débit.J. Vis. Exp.(2019)

Cette vidéo présente un test de mesure des anticorps neutralisants contre le virus respiratoire syncytial (VRS). La pré-incubation avec un sérum contenant des anticorps neutralisants contre le VRS neutralise les particules virales, réduisant ainsi l’infection cellulaire et la formation de plaques. Les cellules infectées par le virus sont ensuite soumises à la fixation, au blocage et au marquage d’anticorps conjugués aux fluorophores pour la visualisation de la plaque. Ce processus permet d’identifier la dilution sérique la plus élevée qui neutralise cinquante pour cent du VRS, représentant le titre de neutralisation.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

REMARQUE : Toutes les étapes doivent être effectuées dans une hotte BSL2, sauf indication contraire. Un titrage viral est nécessaire avant un test de neutralisation par réduction de la plaque (PRN) afin de déterminer la concentration optimale de VRS utilisée dans le test PRN. Il est recommandé d’aliquote les stocks de virus dans un petit volume qui sera décongelé une fois et utilisé pour chaque test NAb. Il est également recommandé d’utiliser le même stock viral pour tous les....

Résultats

Figure 1 : Disposition de la plaque de titrage viral pour la quantification des stocks de VRS.v = stock de virus VRS (v1, stock du lot viral 1 ; v2, stock du lot viral 2 ; v3, stock du lot viral 3), N = puits témoin négatif, X = milieux ajoutés. Le codage couleur ne sert qu’à faciliter la visualisation de la disposition des plaques.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lignée cellulaire
A549	ATCC	CCL-185	fourni par le Dr Keith Chappell, Université du Queensland
Souches virales
RSV A2	ATCC	VR-1540	Numéro de lot 60430286
Réactifs
acétone	Merck	1000142511
Alexa-Fluor âne anti-chèvre IgG (stocké à 4 °C)	Technologies de la vie	A11055
Sel de sodium en poudre CMC	Sigma-Aldrich	Réf. C5678-500G
DMEM (sans sérum, 3,7 g/L de NaHC, P/S) (stocké à 4 °C)	Services scientifiques – Culture tissulaire		Approvisionnement interne MCRI
Sérum fœtal veau (conservé dans des aliquotes de 50 ml à -20 °C)	Interchemin	SFBS-F
Anticorps anti-VRS de chèvre	Merck	AB1128
Antisérum polyclonal humain contre le virus respiratoire syncytial (VRS) (stocké dans des aliquotes de 45 μL à -20 °C)	Ressources BEI	NR-4022	Commande gratuite via BEI Resources sur inscription. Ce sérum fait partie d’un panel d’antisérum humain et d’immunoglobuline contre le VRS (NR-32832)
Poudre M199	Technologies de la vie	31100035
Solution de blocage du diluant pour lait (conservée à 4 °C)	Biorecherche australienne	Référence 50-82-01
Pénicilline/streptomycine (conservée dans des aliquotes de 6 ml à -20 °C)	Technologies de la vie	15140122
s.d.H2O du distributeur Milli-Q	Merck		Dispensation interne
Stérile 1X PBS pour la culture (stocké à 4°C)	Services scientifiques – Culture tissulaire		Approvisionnement interne MCRI
Tween 20 polysorbate	Sigma-Aldrich	Référence 9005-64-5
Consommables généraux
Tubes coniques Falcon (50 mL)	Technologies Invitro	FAL352070
Unité de filtration 0,22 um (500 mL)	Thermo Fisher	NAL5660020
Tubes Eppendorf stériles (1,5 ml)	Australie PL	AM12400
Plaques stériles à fond plat (96 puits avec couvercle)	Interchemin	Référence 655180
Plaques stériles à fond en U (96 puits avec couvercle)	Interchemin	Référence 650180
Pipette sérologique de 5 ml	Sigma-Aldrich	CLS4487-200EA
Pipette sérologique de 10 mL	Interchemin	Référence 607180
Pipette sérologique de 25 mL	Sigma-Aldrich	CLS4251-200EA
Pipette à pointes 1-200 μL Transparent Maxymum Recovery Pré-stérilisé 10RACKS x 96TIPS PKG960	Fisher Biotec	TF-200-L-R-S
Pipette à pointes 5-20 μL Transparent Maxymum Recovery Racked Pré-stérilisé 10RACKS x 96TIPS PKG960	Fisher Biotec	TF-20-L-R-S
Pipette à pointes 100-1000 μLClear Maxymum Recovery Racked Pré-stérilisée 10RACKS x 100TIPS PKG1000	Fisher Biotec	TF-1000-L-R-S
Pipette à pointes 1-10 μL Transparent Maxymum Recovery Pré-stérilisé en rack 10RACKS x 100TIPS PKG1001	Fisher Biotec	TXLF-10-L-R-S
Equipements et logiciels
Système de lecture ELISpot	AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasbourg, Allemagne
Logiciel AID ELISpot version 5.0	AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasbourg, Allemagne
Microsoft Excel 2007

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