Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
REMARQUE : Toutes les étapes doivent être effectuées dans une hotte BSL2, sauf indication contraire. Un titrage viral est nécessaire avant un test de neutralisation par réduction de la plaque (PRN) afin de déterminer la concentration optimale de VRS utilisée dans le test PRN. Il est recommandé d’aliquote les stocks de virus dans un petit volume qui sera décongelé une fois et utilisé pour chaque test NAb. Il est également recommandé d’utiliser le même stock viral pour tous les tests NAb effectués pour tous les échantillons d’une étude. Assurez-vous que le milieu de culture et la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sont chauffés à 37 °C avant de les ajouter aux plaques cellulaires.
1. Titrage viral du VRS
REMARQUE : En fonction du nombre de stocks de virus et du nombre de doublons, la plaque de test peut être configurée conformément à la Figure 1. Chaque stock de virus doit être titré en trois exemplaires sur la plaque de dosage, en commençant par la concentration virale la plus élevée (c’est-à-dire 1:10). Les titrages en série peuvent généralement être de 1:10. Les procédures de culture cellulaire et d’entretien A549 et de culture du VRS sont effectuées à l’aide de procédures standard et ne sont pas incluses dans le présent protocole.
- Plaques de semis (Jour 1)
- Remettre en suspension les cellules A549 dans le milieu Modified Eagles de Dulbecco (DMEM) + 10 % de sérum de veau fœtal (FCS) + 1000 UI de pénicilline/streptomycine (pen/streptocoque) à raison de 4 x 105/mL. Ensemencez des plaques stériles à fond plat de 96 puits avec 100 μL/puits contenant 4 x 104 cellules A459.
- Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C, 5 % de dioxyde de carbone (CO2) (les cellules seront en phase de croissance logarithmique).
note: Utilisez un nouveau flacon de cellules A549 après 23 passages. Il est recommandé de ne pas commencer les expériences lorsqu’un flacon de cellule neuf se trouve encore aux trois premiers passages.
- Infection virale (jour 2)
- Préparation de la dilution en série du virus
- Décongeler rapidement un seul flacon congelé de virus respiratoire syncytial (VRS) dans un bain d’eau à 37 °C jusqu’à ce qu’il soit presque complètement décongelé et placer immédiatement sur de la glace. Préparez 3 réplicats pour chaque stock de virus du VRS à analyser, utilisez une dilution initiale de 1:10 avec 100 μL de virus/puits dilué, et réservez au moins une colonne pour le contrôle négatif.
REMARQUE : La figure 1 montre le contrôle négatif en trois exemplaires.
- Ajouter 100 μL de chaque virus dilué à 1:10 en trois exemplaires de la rangée A d’une plaque stérile à fond en U à 96 puits. Ajouter 90 μL/puits de DMEM + 1000 UI de stylo/streptocoque sans FCS aux rangées B à H.
- Effectuer des dilutions en série 1:10 dans la plaque en transférant 10 μL de la rangée A à la rangée B. Mélanger la solution en pipetant le contenu de haut en bas 5 fois et continuer les dilutions dix fois jusqu’à la rangée H. Jeter les 10 μL finaux de sorte que le volume final dans chaque puits soit de 90 μL.
REMARQUE : Il est important d’utiliser de nouveaux embouts pour chaque dilution.
- Inoculation du virus aux cellules A549
- Récupérez les plaques de cellule A549 préparées la veille. Assurez-vous que les monocouches de cellules A549 dans les plaques de 96 puits sont confluentes à ~80 %. Jetez le support en retournant doucement la plaque et en l’épongeant légèrement sur une serviette en papier absorbante stérile.
- Lavez tous les puits avec 100 μL de PBS deux fois ; jetez l’excès de PBS en retournant doucement la plaque et en tamponnant légèrement sur une serviette en papier absorbante stérile après chaque lavage. Ne laissez pas les assiettes sécher.
- Transférez les dilutions virales de la plaque de titrage viral (Figure 1) vers les puits correspondants sur la plaque cellulaire A549. Incuber la plaque pendant 1 h à 37 °C, 5 % CO2. Après 1 h d’incubation, décantez les surnageants à l’aide d’une pipette (pour éviter la contamination croisée). Retirer 90 μL/puits.
- Ajouter 100 μL de 1x medium 199 (M199, voir tableau des matériaux) + 1,5 % de sel de carboxyméthylcellulose sodique (CMC) à faible viscosité + 2 % de FCS contenant pen/streptocoque dans chaque puits.
REMARQUE : 2 solutions M199 + 4 % de FCS + 2 % de stylo/streptocoque et 3 % de CMC doivent être préparées et stockées à 4 °C pour une utilisation future. Assurez-vous que la solution est réchauffée à 37 °C avant de l’ajouter dans les assiettes.
- Préparez 2 solutions de M199 : 1 sachet/500 ml d’eau distillée + 20 ml de FCS + 10 ml de stylo/streptocoque (pour compléter 2 x MI99). Filtrez la solution à l’aide d’une unité de filtration de 0,22 μm.
- Pour la préparation de 3 % de CMC, ajoutez lentement 15 g de CMC dans 500 ml d’eau distillée. Dissoudre le CMC dans l’eau à l’aide d’un agitateur métallique à 50 °C, ce qui prend environ 1 heure à préparer. Bien mélanger pour obtenir 3 % de CMC et autoclaver la solution.
REMARQUE : Le solide CMC doit être ajouté à l’eau à dissoudre ; L’ajout d’eau au solide sec produit un « amas » de solides très difficile à dissoudre.
- Préparez 1x M199 + 1,5 % de CMC à faible viscosité + 2 % de FCS contenant du stylo/streptocoque en mélangeant 1:1 les 2x M199 et 3 % de CMC préparés à l’étape 1.2.2.4.2.
- Incuber la plaque pendant 3 jours à 37 °C, 5 % CO2.
- Mise au point et analyse de la plaque d’essai (Jour 5)
- Fixation et développement de la plaque de dosage
- Jetez M199 + CMC + 2 % de FCS contenant un stylo/streptocoque en inversant doucement la plaque. Ajouter lentement (pour ne pas perturber la couche cellulaire) 200 μL de tampon de fixation (80 % acétone, 20 % PBS, stocké à -20 °C) pour fixer les cellules. Incuber à -20 °C pendant 20 min.
- Jetez le tampon de fixation et épongez-le doucement sur une serviette en papier absorbante. Laissez sécher la plaque face vers le bas pendant 10 minutes.
note: À partir de cette étape, le dosage peut être effectué à l’extérieur du capot BSL2.
- Préparez une solution bloquant le diluant du lait à 5 % dans du PBS filtré contenant 0,05 % de polysorbate 20 (PBS-polysorbate, voir le tableau des matériaux). Calculer le volume nécessaire pour le blocage d’une plaque en fonction de 200 /puits et 110 puits : 200 μL/puits x 110 puits = 22 mL (1,1 mL de diluant de lait concentré dans 20,9 mL de polysorbate de PBS filtré). À ce stade, préparez également une solution de blocage suffisante pour les anticorps primaires et secondaires. Calculez le volume nécessaire pour chaque solution d’anticorps pour une plaque en fonction de 50 μL/puits et 110 puits : 50 μL/puits x 110 puits = 5,5 mL. Par conséquent, le volume total de solution bloquant le diluant du lait nécessaire pour un essai sur une seule plaque est de 33 mL.
- Ajouter 200 μL/puits de solution de blocage. Incuber la plaque à température ambiante (RT) pendant 30 min. Jetez la solution en inversant doucement l’assiette et épongez sur une serviette en papier absorbante.
- Préparez 1:500 d’anticorps contre le VRS de chèvre X (mAb – anticorps primaire) dilué dans une solution bloquante. Ajouter 50 μL/puits de la solution d’AcM et incuber à 37 °C pendant 1 h. Lavez la plaque 3 fois avec du polysorbate PBS filtré.
- Préparez des IgG (anticorps secondaires) anti-chèvre d’âne Alexa-Fluor 1:5 000 dilués dans une solution bloquante. Ajouter 50 μL/puits de la solution secondaire d’anticorps et incuber à 37 °C pendant 1 h. Lavez la plaque 5 fois avec du polysorbate PBS filtré.
- Lire la plaque sur un lecteur de spot automatisé à l’aide du canal isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et des paramètres de comptage, comme illustré à la figure 2. Enveloppez la plaque dans du papier d’aluminium et rangez-la à 4 °C. Étalonnez l’instrument à l’aide d’une plaque de culture à 96 puits inutilisée et des paramètres de comptage avant le test.
note: Un nouveau balayage en quelques jours est possible si nécessaire. Le réglage de l’étalonnage et du comptage peut être enregistré et utilisé pour un balayage ultérieur si le test utilise le même type de plaque que celui utilisé pour l’étalonnage.
- Vérifiez les images des puits pour détecter la présence de plaques d’artefacts ou de monocouches cellulaires perturbées (figure 3). Exclure les puits avec des monocouches cellulaires perturbées.
note: Selon la taille des plaques d’artefacts, il peut être nécessaire d’effectuer des comptages manuels pour ces puits, ou ces puits peuvent devoir être éliminés de l’analyse des données. Les critères de validité d’un résultat comprennent l’absence de monocouche cellulaire perturbée ou de plaques d’artefacts détectées dans plus d’un puits de réplication et l’absence d’unités formant des plaques (PFU) détectées dans les puits négatifs (puits sans virus ajouté).
- Déterminer les concentrations virales
- Choisissez les deux dernières dilutions où les taches peuvent être comptées clairement. Calculez le nombre moyen de points à partir de puits répétés à la même dilution. Calculer le titre viral (PFU par mL) de l’échantillon de stock à l’aide de la formule ci-dessous :
PFU/mL = Nombre moyen de plaques/(Facteur de dilution × Volume de virus dilué ajouté au puits)
note: La concentration virale déterminée pour chaque stock de VRS peut maintenant être utilisée dans le test PRN (étape 2).
2. Dosage de la neutralisation du VRS
- Plaques de semis (Jour 1)
- Remettre en suspension des cellules A549 dans du DMEM + 10 % de FCS + 1000 UI de stylo/streptocoque à raison de 4 x 105/mL. Ensemencer des plaques stériles à fond plat de 96 puits de 100 μL/puits contenant 4 x 104 cellules A459 et incuber des plaques pendant la nuit à 37 °C, 5 % de CO2 (les cellules seront en phase logarithmique).
note: Utilisez un nouveau flacon de cellules A549 après 23 passages. Il n’est pas recommandé d’utiliser les cellules A549 avant le passage numéro 3.
- Préparation du virus et du sérum (Jour 2)
note: Selon le type d’échantillon, il existe des étapes nécessaires pour le prétraitement des échantillons avant le test NAb. Il est recommandé d’utiliser les sérums standard internationaux RSV qui sont maintenant disponibles sur demande auprès du National Institute for Biological Standards and Controls (NIBSC).
- Préparation de la dilution sérique
- Décongeler l’antisérum de référence pour le VRS humain (sérum de référence, REF) et les échantillons de test sérique à RT. Inonder par la chaleur les échantillons de sérum et l’antisérum de référence dans un bain-marie à 56 °C pendant 30 minutes avant utilisation. Préparez les dilutions selon le gabarit de la plaque (figure 4).
- Préparez une dilution de 1:100 du REF. Préparez un minimum de 110 μL de REF dilué dans du DMEM + stylo/streptocoque sans FCS par plaque de dosage (par exemple, 1,5 μL de REF dans un volume total de 150 μL). Ajouter 110 μL de REF dilué à 1:100 dans le puits A12 d’une plaque stérile à fond en U à 96 puits.
- Ajouter 55 μL de DMEM + stylo/streptocoque sans SCA dans les puits B12 à H12 de la colonne 12. Effectuer des dilutions en série 1:2 dans la plaque en transférant 55 μL de la rangée A à la rangée B, en mélangeant la solution en pipetant le contenu de haut en bas 5 fois et en continuant jusqu’à la rangée H. Jeter les 55 μL restants de milieu de sorte que le volume final dans chaque puits soit de 55 μL. Utilisez des pointes neuves pour chaque dilution.
- Préparer une dilution 1:100 des échantillons de sérum d’essai. Comme tous les échantillons de sérum sont analysés en trois exemplaires, préparer un volume minimum de 110 μL/puits x 3 = 330 μL par échantillon de test de sérum.
- Ajouter 110 μL de chaque échantillon de sérum dilué (1:100 ; S1 = sérum 1, S2 = sérum 2, etc.) aux puits correspondants A1 à A9 ainsi qu’aux puits E1 à E9 de la plaque stérile à 96 puits selon la figure 4.
- Ajouter 55 μL de DMEM + stylo/streptocoque sans SCA dans tous les puits étiquetés X. Effectuer des dilutions en série 1:2 conformément à l’étape 2.2.1.3 jusqu’à la rangée D (pour les échantillons 1, 2 et 3). Jetez les 55 derniers μL de fluide de sorte que le volume final dans chaque puits soit de 55 μL. De même, effectuer les dilutions en série 1:2 pour les échantillons 4, 5 et 6 pour les rangées E à H.
note: Il est essentiel d’utiliser de nouveaux embouts pour chaque dilution.
- Ajouter 55 μL de DMEM + stylo/streptocoque sans SCA dans les puits des colonnes 10 et 11.
- Préparation du virus
- Décongelez rapidement un seul flacon congelé de VRS dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’il soit presque complètement décongelé et placez-le immédiatement sur de la glace.
- Diluer le virus dans du DMEM + stylo/streptocoque sans SCA sur la base de la concentration de l’aliquote du VRS déterminée à l’étape 1.3.2. Appliquez une dilution qui donne environ 200 UFP/puits. Préparez un volume total de 5,5 mL (pour 100 puits).
- Préparation du mélange virus-sérum
- Ajouter 55 μL du virus dilué dans tous les puits des colonnes 1 à 9 et les puits des rangées E-H des colonnes 10 et 11 (témoin positif) conformément au gabarit de la plaque (figure 4).
- Ajouter 55 μL de DMEM + stylo/streptocoque sans SCA à tous les puits des rangées A-D des colonnes 10 et 11 (témoin négatif). Incuber la plaque pendant 1 h à 37 °C, 5 % CO2.
- Inoculation du virus aux cellules A549
- Avant la fin de la période d’incubation, récupérer la ou les plaques cellulaires A549 préparées à l’étape 2.1.1. Assurez-vous que les monocouches de cellules A549 dans les plaques de 96 puits sont confluentes à ~80 %.
- Jetez le support en retournant doucement la plaque et en l’épongeant légèrement sur une serviette en papier absorbante stérile. Lavez tous les puits avec 100 μL de PBS deux fois, jetez l’excès de PBS en retournant doucement la plaque et en tamponnant légèrement sur une serviette en papier absorbante stérile après chaque lavage. Ne laissez pas les assiettes sécher.
- Transférez 100 μL/puits du mélange virus-sérum dans les puits correspondants sur la plaque cellulaire A549 en suivant le gabarit de plaque. Incuber la plaque pendant 1 h à 37 °C, 5 % CO2.
- Après 1 h, à l’aide d’une pipette, prélever 90 μL/puits et ajouter 100 μL de 1x M199 préchauffé + 1,5 % CMC + 2 % FCS + stylo/streptocoque. Incuber la plaque pendant 3 jours à 37 °C, 5 % CO2.
note: Assurez-vous que la solution est réchauffée à 37 °C avant de l’ajouter dans les assiettes.
- Mise au point et analyse de la plaque d’essai (Jour 5)
- Mettre au point la plaque de fixation et de dosage en suivant les étapes 1.3.1.1 à 1.3.1.8.
- Déterminer le titre de neutralisation de 50 %
- Déterminer le titre de neutralisation de 50 % en calculant la distance proportionnelle entre les dilutions sériques réciproques supérieures et inférieures à 50 % des puits témoins « sans sérum » (témoin positif du virus - colonne 10, rangées E-H).
- Compter le nombre d’UFP (c.-à-d. les plaques) résultant d’infections virales individuelles dans les puits de sérum et dans les puits de contrôle du sérum. Calculez le nombre moyen de PFU des puits de contrôle sans sérum et déterminez la valeur de 50 %.
- Identifiez les dilutions sériques dont le nombre est immédiatement supérieur et inférieur à la valeur de 50 % des puits de contrôle sans sérum. À l’aide d’un graphique semi-logarithmique ou d’un tableur, tracez le nombre d’UFP sur l’axe des x (échelle linéaire) et la dilution sérique réciproque sur l’axe des y (échelle logarithmique10). Tracez une ligne entre les deux points et lisez les titres de neutralisation de 50 % des échantillons de sérum testés à partir de cette ligne.
