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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation du tampon
- Tampon d’étiquetage (2x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,9) : Dans 400 ml d’eau distillée désionisée (DD), ajoutez 100 ml de 10x PBS, ajustez le pH à 7,9 avec de l’hydroxyde de sodium (NaOH).
- 3 mM de biotine : Dissoudre 1 mg de biotine dans 588 μL de tampon de marquage.
- 3 mM de Sulfo-tag : Dissoudre 150 nmol de Sulfo-tag dans 50 μL de tampon de marquage.
- Tampon antigénique (5 % BSA) : Dans 500 mL de 1x PBS, ajouter 25 g d’albumine sérique bovine (BSA).
- Préparez une solution d’acide acétique 0,5 M.
- 1,0 M de tampon Tris-HCl pH 9,0 : Préparez 1 M de tampon Tris-HCl et ajustez le pH à 9,0 avec HCl.
- Tampon d’enrobage (3 % de bloqueur A) : Dans 500 ml de 1x PBS, ajoutez 15 g de bloqueur A.
- Tampon de lavage (0,05 % Tween 20, PBST) : Dans 5000 mL de 1x PBS, ajouter 2,5 mL de Tween 20.
- Tampon de lecture (2x Read Buffer T avec tensioactif) : Dans 500 mL d’eau DD, ajoutez 500 mL de 4x Read Buffer T avec tensioactif (Table des matériaux).
- Conservez la biotine et le sulfo-tag dans un congélateur à -20 °C.
note: Les solutions de biotine et de sulfo-tag doivent toujours être fraîchement préparées juste avant la procédure d’étiquetage.
2. Étiqueter l’autoantigène de l’îlot humain avec de la biotine et du sulfo-tag
REMARQUE : Une concentration élevée d’antigène, ≥0,5 mg/mL, est recommandée pour une réaction d’étiquetage plus efficace.
- Déterminer le rapport molaire de l’auto-antigène des îlots de Langerhans humains pour la biotine et le sulfo-tag.
- Obtenez le nombre de molaires de l’antigène en divisant le poids de l’antigène par le poids moléculaire.
- Utilisez le rapport molaire de 1:5 pour l’antigène de plus petit poids moléculaire (≤10 kd) et le rapport molaire de 1:20 pour l’antigène de plus grand poids moléculaire (>50 kd).
- Calculez le volume de biotine ou de sulfo-tag en divisant le nombre molaire par sa concentration.
- Mélangez l’auto-antigène de l’îlot humain avec de la biotine ou du sulfo-tag avec un rapport molaire de 1:5,
note: La protéine dans les systèmes tampons tris ou glycine doit être remplacée par un tampon PBS 2x avec un pH de 7,9 à l’aide de la colonne de spin de calibrage.
- Étant donné que la biotine et le sulfo-tag sont sensibles à la lumière, couvrez les tubes de réaction avec une feuille d’aluminium. Incuber la réaction à température ambiante (RT) pendant 1 h.
- Pendant l’incubation, amorcez la colonne de centrifugation en distribuant trois fois 2 tampons PBS dans la colonne. Centrifuger la solution à 1000 x g pendant 2 min à chaque fois.
note: À l’heure actuelle, la réaction d’étiquetage, par le biais du pontage, se produit toujours et doit être arrêtée.
- Arrêtez la réaction de marquage en purifiant l’auto-antigène des îlots humains marqué. Pour purifier, passez l’auto-antigène dans la colonne de centrifugation et centrifugez la colonne à 1000 x g pendant 2 min.
- Déterminer la concentration de l’antigène marqué (μg/μL) à l’aide de la quantité de protéine de l’antigène et du volume final.
note: En gros, il y aura une rétention de 90 à 95 % de l’antigène marqué après chaque passage de colonne de spin.
- Aliquote de l’antigène marqué et stockez l’antigène marqué à -80 °C.
3. Définir les meilleures concentrations et ratios pour les deux antigènes marqués pour le dosage (Checker Board Assay)
- Préparez deux échantillons de sérum, l’un positif et l’autre négatif, d’un volume total de 200 μL pour chacun.
- Aliquote 4 μL de sérum et ajouter 1 fois PBS jusqu’à ce que le volume final soit de 20 μL par puits pour une plaque d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) à 96 puits. Utilisez la moitié d’une plaque pour l’échantillon positif élevé et l’autre moitié pour l’échantillon négatif, comme le montre la figure 1A.
- Ajouter 10 μL de biotine et 10 μL d’antigène marqué au sulfo-marqueur et effectuer des dilutions en série pour les deux antigènes marqués différemment, comme le montre la figure 1A. Exécutez une dilution en série horizontale pour un antigène marqué et une dilution en série verticale pour l’autre antigène marqué.
- Poursuivre les autres étapes d’analyse décrites aux points 5.3 à 9.1.
- Calculez le rapport entre les signaux de l’échantillon positif élevé et chacun des signaux correspondants de l’échantillon négatif illustré à la figure 1B.
- Identifiez les meilleures concentrations pour les antigènes marqués à la biotine et au sulfo-tag en sélectionnant un point avec le rapport le plus élevé ou presque le plus élevé de positif à négatif. Tenez compte du faible signal de fond de l’échantillon négatif pour identifier le rapport .
note: Le jour 1 du test comprend les étapes 4 à 6.
4. Préparez le tampon antigénique en utilisant la concentration correcte d’antigène marqué à la biotine/sulfo-tag
- Sélectionnez la concentration rationnelle de chaque antigène en fonction du test en damier.
- Préparer 3 mL de solution d’antigène par plaque, en utilisant la concentration rationnelle de l’antigène marqué à la biotine/sulfo-tag pour le tampon d’antigène.
5. Incuber des échantillons de sérum avec un antigène marqué
REMARQUE : Il y a deux protocoles dans cette section, l’un sans traitement à l’acide sérique et l’autre avec traitement à l’acide sérique. Tous les dosages d’auto-anticorps d’îlots, à l’exception du test d’auto-anticorps anti-insuline (IAA), utilisent le protocole régulier sans traitement à l’acide sérique des étapes 5.1 à 5.5, tandis que le test IAA saute ces étapes et utilise le protocole avec traitement à l’acide sérique des étapes 5.6 à 5.9.
- Aliquote 4 μL de sérum et ajouter 1x PBS jusqu’à ce que le volume final soit de 20 μL par puits pour une plaque PCR de 96 puits.
- Ajouter 20 μL de solution d’antigène marquée par puits.
- Couvrez la plaque PCR avec un film d’étanchéité pour éviter la lumière.
- Mettez la plaque sur un shaker (basse vitesse) à RT pendant 2 h.
- Mettez la plaque au réfrigérateur à 4 °C et incubez toute la nuit (18 - 24 h).
note: Le protocole suivant des étapes 5.6 à 5.9 est uniquement conçu pour le dosage IAA et d’autres tests d’auto-anticorps, sautez ces étapes.
- Mélanger 15 μL de sérum avec 18 μL d’acide acétique 0,5 M pour chaque échantillon de sérum. Incuber ce mélange à RT pendant 45 min.
- Préparez la solution d’antigène avec la concentration rationnelle de biotine et l’antigène marqué au sulfo-tag, sur la base du test en damier, en utilisant un tampon d’antigène. Dans chaque puits, aliquote 35 μL de tampon d’antigène, contenant de la biotine et de l’antigène marqué au sulfo-tag, dans une nouvelle plaque de PCR.
- Avant la fin de l’incubation de 45 minutes (étape 5.6), ajouter 8,3 μL de tampon Tris pH 9,0 de 1 M sur le côté de chaque puits de la plaque d’antigène (étape 5.6). Il est important de limiter le mélange entre le tampon Tris et l’antigène. Transférez immédiatement 25 μL de sérum, qui est traité avec de l’acide, à l’étape 5.6, dans chaque puits et agitez la solution. Couvrez la plaque PCR avec un film d’étanchéité pour éviter la lumière.
- Placez la plaque sur un shaker (basse vitesse) à RT pendant 2 h. Mettez la plaque dans le réfrigérateur à 4 °C et laissez la plaque incuber pendant une nuit (18 - 24 h).
6. Préparez la plaque de streptavidine
- Prenez une plaque de streptavidine du réfrigérateur à 4 °C et laissez-la arriver à RT.
- Une fois que la plaque de streptavidine est à RT, ajoutez 150 μL de bloqueur A à 3 % dans chaque puits.
- Couvrez la plaque PCR avec un film d’étanchéité.
- Incuber la plaque dans le réfrigérateur à 4 °C pendant la nuit.
REMARQUE : Le jour 2 de l’analyse comprend les étapes 7 à 9.
7. Transfert du sérum/antigène incube sur la plaque de streptavidine
- Le lendemain, sortez la plaque de streptavidine du réfrigérateur et jetez le tampon de la plaque. Placez des serviettes en papier sèches sur la table et tapotez l’assiette à l’envers jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de tampon à l’intérieur des puits.
- Remplissez la plaque de streptavidine vide avec 150 μL de PBST par puits et jetez le PBST de la plaque pour un total de trois lavages.
- Transvasez 30 μL de sérum/antigène incubé par puits dans la plaque de streptavidine.
- Couvrir l’assiette de papier d’aluminium pour éviter la lumière. Agiter la plaque, à basse température, pendant 1 h.
8. Laver la plaque et ajouter le tampon de lecture
- Jeter les incubés de l’assiette. Ajouter 150 μL de PBST par puits et jeter le PBST de la plaque pour un total de trois lavages.
- Après le lavage, ajoutez 150 μL par puits de tampon de lecture.
note: Il est important d’éviter les bulles d’air dans la solution, car cela affectera la façon dont la plaque est lue sur la machine de lecture de plaques.
