1. Greffage de groupes fonctionnels amines sur des disques de papier cellulosique
- Préparez une feuille de papier carré d’une dimension de 1 cm × 1 cm et 100 disques de papier en papier cellulosique de grade n° 1 d’un diamètre de 6,0 mm (papier filtre à débit moyen) à l’aide d’une perforatrice.
- Pour obtenir les groupes -NH2 sur les disques de papier, mélangez 1 ml de 3-aminopropyltriméthoxysilane (APS) et 10 ml d’acétone dans un flacon en verre de 50 ml dans la hotte. Ajoutez des disques de papier au mélange de réactifs APS fraîchement préparé et incubez pendant 5 heures en remuant orbital (200 tr/min) à température ambiante.
prudence: Manipulez l’APS et l’acétone dans la hotte.
- Décanter l’excès de solution de la bouteille en verre de 50 ml dans un contenant de déchets organiques.
- Ajoutez 10 ml d’acétone dans le flacon en verre, mélangez bien et décantez complètement pour éliminer tout APS n’ayant pas réagi et autres impuretés. Répétez cette étape deux fois.
- Étalez les disques en papier sur l’essuie-tout et placez-les dans un four à 110 °C pendant 3 h. Laissez refroidir les disques en papier. Conservez les disques dans un tube à centrifuger de 50 ml à température ambiante.
- Utilisez la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) pour vérifier la greffe de groupes amines sur le papier carré de cellulose, comme décrit ci-dessous (Figure 1A).
- Allumez l’ordinateur et ouvrez l’instrument de spectroscopie FTIR.
- Ouvrez le logiciel de spectroscopie FTIR.
- Allez dans → mesure initialiser". Les rectangles pour 'BS : KBr', 'Lamp : Infrared' et 'Laser' deviendront verts une fois l'initialisation terminée.
- Choisissez 'Données' sous les rectangles, et sélectionnez ' %Transmittance', 'Happ-Genzel', '45', '4.0' et 'Min : 400, Max : 4000' pour 'Mode de mesure', 'Apodisation', 'Nombre de balayages', 'Résolution' et 'Plage (cm-1)'.
- Cliquez sur « Mesurer ».
- Sélectionnez « Fichier de données » pour les données d'arrière-plan. Notez les commentaires.
- Cliquez sur « BKG » pour obtenir la ligne de base de l'arrière-plan.
- Fixez le papier carré sur le porte-échantillon de film.
- Sélectionnez 'Fichier de données' pour les exemples de données. Notez les commentaires.
- Cliquez sur 'Sample' pour obtenir les spectres de l'échantillon.
- Fermez l’application de spectroscopie FTIR et éteignez l’ordinateur.
- Répétez les étapes ci-dessus (étapes 1.1 à 1.6) pour préparer du papier carré et des disques de cellulose de grade n° 113 fonctionnalisés aux amines (papier filtre à écoulement rapide) et obtenir les spectres FTIR pour le papier carré de grade n° 113 (figure 1B).
2. Test immuno-enzymatique (ELISA) sur papier pour la détection des immunoglobulines G (IgG)
- Ajouter 5 ml de solution de glutaraldéhyde à 0,05 % (préparée dans un tampon PBS de 50 mM, pH 7,4) dans un flacon en verre de 20 ml. Plongez 15 disques de papier filtre à débit moyen fonctionnalisés aux amines dans cette solution et conservez-les pendant 1 heure en les secouant à température ambiante.
- En même temps, répétez l’étape 2.1 pour préparer 15 autres disques de papier filtre à flux rapide fonctionnalisés à l’aldéhyde.
prudence: Manipulez le glutaraldéhyde dans la hotte.
- Pour éliminer le glutaraldéhyde qui n’a pas réagi des disques de papier, placez les 15 disques de papier filtre à débit moyen dans un tube à centrifuger de 15 ml et les 15 disques de papier filtre à débit rapide dans un autre tube à centrifuger de 15 ml. Ajoutez 5 ml d’eau DI dans chaque tube et agitez les tubes pendant 10 secondes. Retirez l’eau en aspirant avec une pipette. Répétez l’opération deux fois pour éliminer le glutaraldéhyde qui n’a pas réagi.
- Faites sécher les disques de papier dans un four à 37 °C.
- Ajouter 5 μl et 8 μl d’anticorps de 0,025 mg/ml d’anticorps de souris à fragment IgG-Fc dans chacun des disques de papier filtre à débit moyen et à débit rapide, respectivement, et incuber pendant 20 min.
- Ajouter 10 μl de 50 mM de PBS (pH 7,4) à chaque disque de papier sans retirer les anticorps et incuber pendant 40 min pour la réaction aux amines aldéhydes.
- Lavez les disques en papier avec 0,2 ml de tampon de lavage sur une serviette en papier. Répétez le lavage trois fois.
- Faites sécher les disques de papier dans un four à 37 °C.
- Bloquez les disques de papier avec 15 μl de tampon de blocage pendant 10 min à température ambiante.
- Lavez chaque disque de papier avec 0,2 ml de tampon de lavage sur une serviette en papier. Répétez le lavage trois fois.
- Exécutez des normes IgG.
- Chargez 10 μl de diverses concentrations d’IgG (p. ex., 0, 10, 125, 250 et 500 ng/ml dans du PBS) sur chaque disque en trois exemplaires. Incuber pendant 1 h à température ambiante.
- Lavez les disques en papier avec 0,2 ml de tampon de lavage sur une serviette en papier. Répétez le lavage trois fois.
- Chargez 10 μl d’anticorps de fragment IgG-Fc de souris conjugués HRP (1:10 000, 10 mM PBS, pH 7,4) et incubez pendant 1 heure à température ambiante.
- Lavez les disques en papier avec 0,2 ml de tampon de lavage sur une serviette en papier. Répétez le lavage trois fois.
note: Il n’est pas nécessaire de retirer le tampon de lavage car les résultats ne sont pas affectés par la présence d’un tampon.
- Chargez un mélange de 10 μl de TMB et de peroxyde d’hydrogène sur chaque disque.
- Prenez des images de tous les disques en papier avec un appareil photo numérique ou un smartphone après 5 min d’incubation.
note: Dans la figure 2A, « 0 » représente les disques en papier traités avec l'immobilisation des anticorps de capture, et la solution anticorps-HRP/TMB sans sérum IgG.
- Analysez l’intensité de chaque disque de papier dans l’image à l’aide de l’image J.
- Convertissez les images prises à l'étape 3.15 au format .tif.
- Ouvrez le logiciel 'Image J'.
- Allez dans 'Fichier →'ouvrir', choisissez l'image à analyser.
- Choisissez le bouton de forme 'Ovale'.
- Allez dans → d'image → 32 bits ».
- Allez dans → Modifier inverser".
- Allez dans 'Analyser → mesurer'.
- Copiez et analysez les données dans une feuille de calcul.
