1. Formation du biofilm de C. tropicalis
- Préparez des biofilms de Candida dans une plaque de microtitration en polystyrène à fond plat de 96 puits, comme décrit précédemment (figure 1).
- Ajouter 100 μL de culture de C. tropicalis (à partir de 10 souches de6 cellules/mL, préparées comme ci-dessus) dans une plaque de microtitration à 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux (figure 2A). Conservez les deux dernières colonnes (11 et 12) comme témoins négatifs « pas de champignon plus sérum » et « pas de champignon et pas de sérum » en n'ajoutant pas de cellules fongiques. Remplissez les colonnes 11 et 12 avec 100 μL d’acide morpholinepropanesulfonique (MOPS) du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) seul.
- Couvrez la plaque de microtitration avec un couvercle et du papier d’aluminium. Incuber la plaque pendant 24 h à 37 °C dans des conditions stationnaires.
- Le lendemain, aspirez soigneusement le milieu à l’aide d’une pipette multicanaux (sans toucher ni perturber les biofilms). Tapotez doucement la plaque en position inversée sur des feuilles de transfert pour éliminer tout produit résiduel.
- Lavez la plaque avec 200 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (par puits) à l’aide d’une pipette multicanaux. Ajoutez du PBS très doucement le long des parois latérales du puits pour éviter de perturber les biofilms. Aspirez soigneusement le PBS à l’aide d’une pipette multicanaux. Répétez le lavage PBS 2 fois (un total de trois lavages).
- Pour éliminer l’excès de PBS, faites sécher la plaque à l’air libre (sans le couvercle) pendant 30 min à température ambiante, à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique.
2. Traitement du biofilm avec des anticorps
REMARQUE : Les biofilms peuvent désormais être traités pour évaluer l’inhibition de la maturation du biofilm par les anticorps. Le sérum murin a été utilisé comme source d’anticorps polyclonaux. Différents groupes de souris immunisées contre Sap2 (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis et Sap2-parapsilosis) ainsi que des souris immunisées contre le placebo ont été saignés rétro-orbitaire et le sérum a été isolé. La présence d’anticorps anti-Sap2 a été confirmée à l’aide d’un test immuno-enzymatique (ELISA) spécifique de Sap2.
- Effectuer l’inactivation thermique du sérum (source d’anticorps polyclonaux) à 56 °C pendant 30 min avant l’utilisation afin d’exclure le rôle du complément dans l’activité inhibitrice. Inactivez le sérum à la chaleur avant de le diluer.
note: Utilisez du sérum de souris immunisées contre un placebo, de souris préimmunes et de sérum appauvri en anticorps spécifiques de Sap2 comme témoins supplémentaires. Le sérum appauvri en anticorps a été préparé selon une étude précédente. Parmi les dilutions en série (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1 600, 1:3 200, 1:6 400 et 1:12 800) pour le sérum testé dans ce protocole, une inhibition de la maturation du biofilm a été observée à 1:25, 1:50 et 1:100 ; Par conséquent, 1:50 a été choisi pour trouver un équilibre entre l’inhibition et la consommation sérique.
- Préparer des dilutions en série d’échantillons de sérum inactivés par la chaleur dans un milieu stérile RPMI 1640 MOPS (1:50). Utilisez une dilution sérique commune (1:50) pour tous les échantillons de sérum à tester pour l’inhibition de la maturation du biofilm.
- Ajouter 100 μL de la dilution sérique sélectionnée dans chaque puits de la plaque de microtitration à 96 puits. Pour chaque échantillon, ajoutez les dilutions sériques en double, selon la disposition ci-jointe (figure 2B).
- Dans la colonne 10, n’ajoutez pas de dilution sérique ; ajoutez uniquement le milieu RPMI 1640 MOPS pour le témoin positif composé uniquement de champignons.
note: Les rangées G1-G8 et H1-H8 de la colonne 10 présentaient initialement des cellules fongiques dans les RPMI-MOPS. Cependant, alors que le RPMI-MOPS a été ajouté à la colonne 10 même après 24 h, les rangées G1 à G8 ont servi de contrôle PBS et les rangées H1 à H8 de contrôle sans sérum après 24 h.
- Dans la colonne 11, ajouter une dilution de 1:50 du sérum dans tous les puits pour servir de témoin négatif sérique sans champignon plus.
- Dans la colonne 12, n’ajoutez pas de dilution sérique à un puits ; gardez-la comme témoin négatif sans champignon ni sérum.
- Couvrez l’assiette avec un couvercle et du papier d’aluminium. Incuber la plaque pendant 24 h à 37 °C.
3. Estimation de l’activité métabolique du biofilm
- Le lendemain, aspirez soigneusement le sérum à l’aide d’une pipette multicanaux (sans toucher ni perturber les biofilms). Tapotez doucement la plaque en position inversée sur des feuilles de buvard pour éliminer tout résidu de sérum.
- Lavez la plaque avec 200 μL de 1x PBS (par puits) à l’aide d’une pipette multicanaux, en ajoutant le PBS le long des parois latérales du puits pour éviter de perturber les biofilms. Aspirez soigneusement le PBS à l’aide d’une pipette multicanaux et répétez le lavage PBS 2 fois (soit un total de trois lavages). Faites sécher la plaque à l’air libre (sans le couvercle) pendant 30 min à température ambiante, à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique pour sécher tout excès de PBS.
- Préparation de XTT(2,3-bis-(2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-2H-tétrazolium-5-carboxanilide)/ménadione :
- Préparez XTT dans du lactate de Ringers stérile sous forme de solution à 0,5 g/L. Dissoudre 25 mg de XTT dans 50 ml de Ringers Lactate stérilisé par filtre. Aliquote 10 mL dans des tubes séparés recouverts d’une feuille d’aluminium et conserver à -80 °C.
- Préparez la ménadione sous forme de bouillon de 10 mM. Dissoudre 8,6 mg de ménadione dans 5 mL d’acétone et répartir 50 μL dans 100 microtubes distincts. Conservez les aliquotes à -80 °C.
- Préparez la solution XTT/ménadione juste avant l’utilisation en prenant 10 ml de XTT et en ajoutant 1 μL de ménadione pour obtenir une solution de travail de 1 μM.
- Ajouter 100 μL de la solution XTT/ménadione par puits de la plaque de microtitration à 96 puits. Couvrez l’assiette avec un couvercle et du papier d’aluminium. Incuber la plaque pendant 2 h à 37 °C dans l’obscurité.
- Transvasez 80 μL du surnageant coloré de chaque puits dans une plaque fraîche à 96 puits. Lire la plaque à 490 nm.
- Calculer la moyenne des valeurs d’absorbance des puits de la colonne 10 (témoin positif pour les champignons seulement), qui servira de valeur de référence pour calculer le pourcentage d’inhibition du biofilm par chaque échantillon de sérum à l’aide de l’équation (1).
% d’inhibition du biofilm = 100 - 
